Chick^GFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

1. Nöral Tüp Ablasyonları için Mikro neşter hazırlanması Piyasada bulunan çelik dikiş iğnesinden mikro neşteri şekillendirin. İlk önce, güçlendirilmiş bir tezgah taşlama makinesine monte edilmiş bir taşlama tekerleği kullanarak iğneyi her iki tarafta düzleştirin. Neşteri şekillendirmeye başlayın, ilk olarak kaba sınıf bir Arkansas taşında, kontrollü dairesel bir hareket kullanarak, alternatif yönlerde, iğnenin her iki tarafında. Ultra ince bir mikro neşteri şekillendirmek için ekstra ince dereceli Arkansas taşında aynı keskinleştirme hareketlerini iyi tanımlanmış bir kesme kenarı ile sürdürin(Şekil 1A, B).NOT: Mikro neştere alternatifler elektrolitik olarak keskinleştirilmiş iğneler, piyasada bulunan tungsten iğneleri veya çekilmiş cam iğneler olabilir. 2. Yabani Tip ve GFP Yumurtalarını İstenilen Aşamaya Kuluçkaya İndirin Döllenmiş tavuk yumurtalarını ve transgenik GFP tavuk yumurtalarını, bu sıcaklıkta gelişim durdurulduğu için inkübasyondan önce 14 – 15 ° C’de soğutulmuş bir inkübatörde saklayın. Yumurtaları birkaç gün, bir haftaya kadar saklayın. Gelişmeye başlamak için, vahşi tip ve GFP yumurtalarını yatay olarak bir tepsiye yerleştirin ve aynı anda nemlendirilmiş bir şekilde kuluçkaya yatırarak ( – 60) 37.5 ºC’de inkübatör, böylece embriyolar nöral tüp greftleme için eşleşen aşamalardadır. Vagal nöral tüp greftlemenin gerçekleştirilmesi için gelişimin 10 – 12 somit aşamasında embriyo elde etmek, hamburger ve Hamilton21’ingelişim tablolarına göre yumurtaları 1,5 gün (33 – 38 saat) kuluçkaya yatırmak ve embriyoları evrelamak. 3. Pencereleme ve Aşılama için Yumurta Hazırlayın Pencereleme için her seferinde bir yumurtayı özel yapım bir yumurta tutucuya taşıyın. Yumurtanın sivri ucunun üst yüzeyine düz makasla tekrar tekrar dokunarak yumurta kabuğunda küçük bir delik açın. 181/2 G hipodermik iğne ve 5 ml şırınga ile yumurtadan 2 – 3 ml albümin çıkarın. Albümin çıkarılması yumurtanın içindeki sarıyı indirir ve embriyoya herhangi bir zarar vermeden sonraki pencereyi kolaylaştırır. Albümin’i atın. Deliği ince makasla kesilmiş küçük bir şeffaf bant şeridi ile kapatın. Kavisli makas kullanarak, yumurta kabuğunun üst yüzeyindeki başka bir deliğe dokunun. Makasın ucunu deliğe yerleştirin ve makası tezgaha paralel tutarak, kabuğun üzerine ~2 cm çapında bir pencere kesmek için dairesel bir hareketle çalışın. Makası sabit bir konumda tutun ve yumurtayı döndürün. Yumurta kabuğunun çıkarılan diskini atın. E1.5’te embriyo, sarının üstünde daha koyu sarı bir disk olarak tanınabilir. Cımbız kullanarak yumurtanın içine düşen kabuk kalıntılarını çıkarın. Döllenmemiş yumurtaları atın (aksi takdirde açık sarı sarısının üstündeki küçük beyaz bir nokta ile tanımlanır). 4. Konak Embriyoyu Aşılanmış Doku Alacak Şekilde Hazırlayın Stereo mikroskobu göz seviyesine ayarlayın ve yansımalara neden olmadan embriyoyu yeterince aydınlatmak için kaz tüyü ışık kaynağının yönünü optimize edin. Embriyoyu uygunşekilde görselleştirmek için, bir ağız tüpü ve çekilmiş bir cam mikro pipet kullanarak koyu sarı diskin merkezinin altına az miktarda Hint mürekkebi enjekte edin (Şekil 1C, Oii). 100 μg/ml son konsantrasyonda Penisilin/Streptomisicin içeren PBS ile 50:50 mürekkep hazırlayın. Mikro pipeti blastoderm çevresinin dışındaki yumurta sarısı zarına yerleştirin, ardından ucunu embriyonun hemen altına dikkatlice açılın. Ağız tüpüne üfleyerek embriyonun altına mürekkep teslim edin. Ağız pipetleme izin verilmiyorsa, bunun yerine 1 ml şırıngar kullanın. Embriyonun altına kontaminasyona yol açabilecek herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat edin, ardından cam mikro pipeti dikkatlice çıkarın. Bu, hassas bir şekilde yapılmadığı takdirde embriyonun ölümüne yol açabilecek hassas bir adımdır. Hamburger ve Hamilton21’e atıfta bulunarak embriyoyu sahnele ve sahneyi bir laboratuvar kitabına kaydet. Bir iğne tutucuya monte edilmiş özel yapılmış bir mikro neşter (veya ince bir tungsten iğnesi) kullanarak, mikro cerrahinin yapılacağı alanın yanında, vitelline zarında çok küçük bir yara yapın. Embriyo ile zar arasında boşluk oluşturmak için membran yırtığına (cam mikro pipet ve ağız tüpü kullanarak) 2 – 3 damla PBS dikkatlice uygulayın. Mikro cerrahinin gerçekleşeceği tüm bölgeyi ortaya çıkarmak için membranda daha büyük bir pencere kesin. Tüm dorsal nöral tüp boyunca rostral ve kaudal enine kesilerden başlayarak mikro neşteri kullanarak ilgi çekici sinir tüpü bölgesini çıkarın (videoda somite 1 ila 7 seviyesinde). Sinir tüpüne zarar vermeden, sinir tüpünü çevre dokulardan ayırmak için sinir tüpü ile somitler arasında iki taraflı kesin. Sinir tüpünü alttaki notochord’dan çok nazikçe ayırın, bu da bozulmadan kalmalıdır. Başarılı nöral tüp eksizyonun tüm çevre dokuları mükemmel bir şekilde sağlam bırakacağını unutmayın (Şekil 2). Çıkarılan sinir tüpünü cam bir mikro pipete emiş ederek çıkarın, sonra atın. Sinir tüpü ablasyon seviyesini bir laboratuvar kitabına kaydedin. Konak embriyo artık donör sinir tüpünü almaya hazır. 5. Donör Greft Dokusunu Hazırlayın FITC filtreli floresan stereo mikroskop altında görüntüleyerek pencereli, sahneyle eşleşen bir GFP embriyosu seçin. GFP floresan, somitleri görselleştirmeyi ve embriyoyu sahnelemeyi çok kolaylaştırır. Aşama uyumlu bir embriyo belirlendikten sonra, embriyonun etrafındaki dikdörtgen şeklinde Pascheff-Wolff yay makası (Şekil 1C, l) ile 4 kesi yaparak embriyoyu yumurtadan çıkarın ve ardından bir embriyo kaşığı ile hafifçe alın. Embriyoyu sylgard polimer bazlı kare bir saat camına yerleştirin. Bağlı yumurta sarısını çıkarmak için embriyoyu Dumont #5 cımbızla hafifçe sallayın. Vitelline zarını çıkarın ve embriyoyu paslanmaz minutien pimler kullanarak polimer tabanına sabitleyin (Şekil 1C). Yay makasını kullanarak, konak embriyodan çıkarılan aynı bölgede, sinir tüpü ve çevresindeki somitler etrafında dikdörtgen şeklinde 4 kesi yapın. Plastik transfer pipeti kullanarak, donör GFP embriyosundan gelen nöral tüpü ve somit dokuları Pen/Strep PBS’de% 0,2 pankreatin içeren bir saat camına aktarın. Dokuları ayırmaya yardımcı olmak için ENZYMATIC sindirimin RT’de 10 dakika boyunca devam etmesine izin verin. Enzimde inkübasyondan sonra, sinir tüpünü tüm bitişik dokulardan manuel olarak ayırmak için bir tutamağa monte edilmiş paslanmaz minutien pimleri kullanın. Bir cam mikro pipet kullanarak, fazla pankreası durulamak ve enzimatik sindirimi durdurmak için, ayrışmış sinir tüpünü buz üzerinde DMEM +% 10 serum(örneğin,keçi, at veya fetal baldır) içeren başka bir saat camına aktarın. 5 dakika sonra, parçalanmış sinir tüpü civciv konağına ortopedik olarak aşılamaya hazırdır(Şekil 2 ve S1). 6. Dokuyu Aşıla Bir cam mikro pipet kullanarak, parçalanmış sinir tüpünü saat camından konak embriyoya dikkatlice aktarın. Sinir tüpünü doğru ön-arka yönde konumlandırın ve mikro neşteri kullanarak civciv konağının eksize bölgesine bitişik eksplantı hafifçe itin. Sinir tüpünün yönünü belirlemek için sırt yüzeyine küçük bir çentik takmış veya küçük bir çentik keserek küçük bir ektoderm parçası bırakın. Gerekirse, eksplantı eksizyon bölgesinin tam boyutuna kırpmak için mikro neşteri kullanın. Sinir tüpünü ablated bölgeye hafifçe yönlendirin ve sırt tarafının doğru yönlendirilmesini yapacak şekilde konumlandırın. Grefti çevreleyen PBS ve/veya sıvıyı çıkarmak için ağız tüpüne monte edilmiş bir cam mikro pipet kullanın. Bu, donör ve konak dokuların yapışmasını ve greftin kurulmasını sağlar. Dehidrasyon ve kirlenmeyi önlemek için tüm pencereyi 24 mm genişliğinde şeffaf bantla kapatın. Yumurta kabuğuna kalemle işaretleyerek kimerik embriyoyu etiketleyin ve numarasını laboratuvar kitabına kaydedin. Daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin. 7. Konak Embriyonun Kan Damarlarına DiI Enjekte Edin İstenilen deneysel zaman noktasında (burada, 3 – 10 gün sonra), chimeric embriyosunu inkübatörden alın ve yumurta içindeki embriyoya erişmek için düz makas kullanarak şeffaf bandı çıkarın. Gerekirse, makası kullanarak pencereyi kabukta büyütün. Kabuğa tutturulmuşsa, kanamaya neden olacak ve kan damarı etiketlemesini tehlikeye atacak olan koryallantoik zara zarar vermemeye dikkat edin. Kan akışının embriyoya doğru yönlendirildiğinden emin olmak için yumurta sarısı üzerinde erişilebilir bir damar seçin. Vitelline damarlarından birinin dallanma noktasını seçin (Şekil 3B, C).NOT: E6.5 – E7.5’te, yumurta sarısı damarlarına erişmek için koryallantoik zarın cımbızla hafifçe kenara taşınması gerekebilir. E8.5’ten sonra, tek seçenek koryallantoik membran damarlarından birine enjekte etmektir, çünkü bu aşamada, koryallantoik membran embriyoyu tamamen kapsar. Seçilen enjeksiyon noktasının üzerindeki vitelline zarını, zıt yönlerde yırtarak iki Dumont #5 cımbız kullanarak çıkarın. Dumont #5 kullanarak çekilmiş bir cam iğneyi kırın ve CellTracker CM-DiI ile yüklemeden önce çapını damarın yaklaşık boyutuna ayarlayın. DiI stok çözümünü DMSO’da 40 μg/μl’de yapın ve -20 °C’de saklayın. Çalışma solüsyonunun 4 μg/μl konsantrasyonda 0,3 M sakkaroz/PBS olarak hazırlanması. Ağız tüpü ile emme kullanarak iğneye 0,3 M sakkaroz / PBS’de 5 – 10 μl Arasında DiI epire edin. Daha eski embriyolar 25 μl veya daha fazla gerekebilir. E8.5’ten itibaren embriyolar, DiI yüklü cam iğne ile bıçaklamadan önce bir Dumont #5 ile pozisyonda tutulması gerekebilecek daha büyük, daha kaslı damarlara sahiptir. İğneyi damara hızlı bir şekilde sokun ve dii’nin pıhtı oluşturmadan kan akışını yavaşça birleştirmesini sağlamak için ağız tüpüyle sürekli üfleyin. Alternatif olarak, DiI teslimatı için bir basınç enjektörü kullanın. 8. Kesitleme veya Kepenk Muayenesi için Embriyoları Hasat Edin Embriyo içinde mümkün olduğunca fazla DiI tutmak için, embriyoyu yumurta sarısından kurtarmak için, delikli bir kaşık üzerine kepçeyle atarak ve kan damarlarını ve bağ dokularını bir çift düz makasla keserek enjeksiyondan hemen sonra hasat edin. Gevşek zarları çıkarın ve ilgi organlarını(yani,bu öğreticideki akciğerleri ve sindirim sistemini) parçalara ayırın, dokuyu sıkıştırmamaya büyük özen göstererek, dii’nin difüzyonunu oluşturur. RT’de 1 – 2 saat boyunca% 4 PFA’ya daldırarak dokuları hemen sabitle. Dokuyu PBS’de 5 dakika, daha sonra 5 μg/ml DAPI içeren PBS’de 15 dakika durulayın. Numuneleri tüm montaj incelemesi için köprülü bir mikroskop kaydırağından monte edin veya kriyo kesitleme için gömün.