병아리^GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

1. 신경관 절제용 마이크로 메스 준비 시판되는 강철 재봉 바늘에서 마이크로 메스를 형성한다. 먼저 전원 벤치 그라인더에 장착 된 연삭 휠을 사용하여 양쪽의 바늘을 평평하게합니다. 메스를 형성하기 시작, 먼저 거친 학년 아칸소 돌에 제어 된 원형 운동을 사용하여, 대체 방향으로, 바늘의 양쪽에. 매우 미세한 미세한 미세 한 미세 메스를 형성하기 위해 여분의 미세 한 학년 아칸소 돌에 동일한 선명 한 움직임을 수행, 잘 정의 된 절삭 날(그림 1A, B).참고: 마이크로 메스에 대한 대안은 전정적으로 날카로운 바늘, 시판되는 텅스텐 바늘 또는 당겨진 유리 바늘일 수 있습니다. 2. 원하는 단계에 야생 유형과 GFP 계란을 인큐베이션 이 온도에서 개발이 중단됨에 따라 인큐베이션 전에 14-15°C의 냉각된 인큐베이터에 수정된 닭고기 계란과 트랜스제닉 GFP 치킨 알을 보관합니다. 계란을 며칠 동안 보관하십시오. 개발을 시작하려면 야생 유형과 GFP 알을 수평으로 트레이에 놓고 가습 (58 – 60 %) 동시에 배양합니다. 37.5 ºC에서 배아가 신경관 이식을 위한 일치하는 단계에 있도록 인큐베이터. 10-12소미트 단계에서 혈관 신경관 이식을 수행하기 위한 개발 단계, 1.5일 동안 계란을 배양(33-38시간) 및 함부르크와해밀턴(21)의개발 테이블에 따라 단계 배아를 배양한다. 3. 창과 접목을 위한 계란 준비 한 번에 한 개의 달걀 을 주문 제작 한 계란 홀더로 이동하여 창을 지정합니다. 계란의 뾰족한 끝의 상부 표면에 직선 가위를 가진 반복적으로 두드려 계란 껍질에 작은 구멍을 만듭니다. 181/2 G 피하 바늘과 5ml 주사기로 달걀에서 알부민 2-3 ml를 제거하십시오. 알부민을 제거하면 알란 내의 노른자를 낮추고 배아에 손상을 주지 않으면서 후속 창을 용이하게 합니다. 알부민을 폐기합니다. 미세 한 가위로 크기로 잘라 투명 테이프의 작은 스트립으로 구멍을 밀봉. 곡선 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상부 표면에 있는 다른 구멍을 누릅니다. 가위의 끝을 구멍에 삽입하고 가위를 벤치와 평행하게 유지하여 원단 동작으로 작동하여 쉘 위에 ~2cm 직경의 창을 자른다. 가위를 고정 된 위치에 유지하고 계란을 회전시십시오. 제거된 계란 껍질 디스크를 폐기합니다. E1.5에서 배아는 노른자 위에 어두운 노란색 디스크로 인식할 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 계란 내에 떨어진 껍질 파편을 제거합니다. 수정되지 않은 계란을 버리십시오 (그렇지 않으면 밝은 노란색 노른자 위에 작은 흰색 반점으로 식별됨). 4. 접목 조직을 받기 위해 호스트 배아를 준비합니다. 스테레오 현미경을 눈 높이로 조정하고 구스넥 광원의 방향을 최적화하여 반사를 일으키지 않고 배아를 적절하게 비춥춥시킵니다. 적절한배아를 시각화하려면, 입 튜브와 당겨진 유리 마이크로 파이펫(도 1C, Oii)를사용하여 어두운 노란색 디스크의 중앙 아래에 소량의 인도 잉크를 주입하십시오. 100 μg/ml 최종 농도에서 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 PBS로 잉크 50:50을 준비한다. blastoderm의 둘레 바깥에 노른자 멤브레인을 통해 마이크로 파이펫을 삽입한 다음 배아 바로 아래에 팁을 조심스럽게 각도로 기울입니다. 입 튜브에 불어 배아 아래에 잉크를 전달합니다. 구강 파이프팅이 허용되지 않는 경우 대신 1ml 주사기를 사용하십시오. 오염으로 이어질 수있는 배아 아래에 기포를 도입하지 않도록주의한 다음 유리 마이크로 파이펫을 조심스럽게 제거하십시오. 이것은 정밀하게 행하지 않을 경우 배아의 죽음으로 이어질 수있는 섬세한 단계입니다. 햄버거와 해밀턴(21)을 참조하여 배아를 무대와 실험실 책에서 무대를 기록합니다. 바늘 홀더에 장착 된 사용자 정의 만든 마이크로 메스 (또는 미세 텅스텐 바늘)를 사용하여, 마이크로 수술이 수행 될 영역 옆에, vitelline 막에 매우 작은 가스를 합니다. 조심스럽게 배아와 멤브레인 사이의 공간을 만들기 위해 멤브레인 눈물 (유리 마이크로 파이펫과 입 튜브를 사용하여) 막 눈물 위에 PBS 의 2 – 3 방울을 적용합니다. 멤브레인의 더 큰 창을 잘라 미세 수술이 일어날 전체 영역을 노출시킵니다. 전체 등쪽 신경관에서 로스트랄 및 caudal 횡단 절개 (비디오에서 소미트 1 에서 7의 수준에서)에서 시작하여 마이크로 메스를 사용하여 관심있는 신경 관 영역을 제거하십시오. 신경관과 소미트 사이를 양측으로 잘라 주변 조직으로부터 신경관을 분리하소미를 손상시키지 않고 잘라냅니다. 매우 부드럽게 그대로 유지해야 기본 notochord에서 신경 관을 분리합니다. 성공적인 신경관 절개는 모든 주변 조직을 완벽하게 그대로 둡니다(그림2). 절제된 신경관을 유리 마이크로 파이펫으로 흡입하여 제거한 다음 폐기하십시오. 실험실 책에서 신경관 절제 수준을 기록합니다. 호스트 태아는 지금 기증자 신경관을 수신할 준비가 되었습니다. 5. 기증자 이식 조직 준비 FITC 필터를 사용하는 형광 스테레오 현미경으로 볼 수 있는 창, 스테이지 일치 GFP 배아를 선택합니다. GFP 형광은 소닉을 시각화하고 배아를 단계화하는 것을 매우 쉽게 합니다. 단계일치 배아가 확인되면, 파셰프-울프 스프링 가위(도1C, l)를배아 주위의 직사각형 모양으로 4절개하여 달걀에서 배아를 제거한 다음, 배아 숟가락으로 부드럽게 집어들게 한다. 실가드 폴리머 베이스가 있는 사각형 시계 유리에 배아를 놓습니다. 두몬트 #5 핀셋으로 배아를 부드럽게 흔들어 부착된 노른자를 제거합니다. 비텔린 멤브레인을 제거하고 스테인레스 미노티엔핀(도 1C)을사용하여 배아를 폴리머 베이스에 고정한다. 스프링 가위를 사용하여, 주조 배아에서 제거 된 동일한 영역에서 신경관 과 주변 소미트 주위에 직사각형 모양으로 4 절개를합니다. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 기증자 GFP 배아에서 펜/스트렙 PBS에서 0.2%의 췌장이 들어있는 시계 유리로 신경관 및 소미트 조직을 이송합니다. 효소 소화가 RT에서 10분 동안 진행하여 조직을 분리하도록 허용합니다. 효소에서 인큐베이션 후 손잡이에 장착된 스테인리스 미노티엔 핀을 사용하여 모든 인접한 조직으로부터 신경관을 수동으로 분리하십시오. 유리 마이크로 파이펫을 사용하여, DMEM + 10 % 혈청(예 :염소, 말 또는 태아 송아지)을 포함하는 다른 시계 유리로 해리 된 신경 관을 얼음에 옮기고, 여분의 췌장을 헹구고 효소 소화를 중지합니다. 5 분 후, 해부 신경 관은 병아리 호스트(도 2 및 S1)에정형 소식으로 이식 할 준비가되어 있습니다. 6. 조직 접목 유리 마이크로 파이펫을 사용하여 해부된 신경관을 시계 유리에서 숙주 배아로 조심스럽게 이송합니다. 신경관을 올바른 전방 후방 방향으로 배치하고 마이크로 메스를 사용하여 병아리 숙주의 절제 부위에 인접한 엑셀을 부드럽게 밀어 넣습니다. 신경관의 방향을 확인하기 위해 등대 표면에 작은 닉을 자르거나 작은 닉을 절단하여 작은 자궁 절제술조각을 둡니다. 필요한 경우 마이크로 메스를 사용하여 절제된 영역의 정확한 크기로 엑셀을 다듬습니다. 신경관을 압착 부위로 부드럽게 안내하고 등쪽측이 올바르게 방향을 지정하는 것을 배치합니다. 입 튜브에 장착된 유리 마이크로 파이펫을 사용하여 접목을 둘러싼 PBS 및/또는 유체를 제거합니다. 이것은 기증자와 호스트 조직이 준수하고 접목이 확립되는 것을 돕습니다. 탈수및 오염을 방지하기 위해 24mm 너비의 투명 테이프로 창 전체를 밀봉하십시오. 달걀 껍질에 연필로 표시하여 키메라 배아에 라벨을 부착하고 실험실 책에 그 숫자를 기록합니다. 추가 개발을 위해 인큐베이터에 계란을 반환합니다. 7. 호스트 배아의 혈관에 DiI주입 원하는 실험 시점(여기서 3-10일 후)에서 인큐베이터에서 키메라 배아를 회수하고 직선 가위를 사용하여 투명 테이프를 제거하여 계란 내의 배아에 접근할 수 있습니다. 필요한 경우 가위를 사용하여 셸의 창을 확대합니다. 껍질에 부착되어 출혈을 초래하고 혈관 라벨링을 위태롭게 하는 조개막을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 노른자에서 혈액 흐름이 배아를 향해 향하도록 접근 가능한 정맥을 선택하십시오. 진동 정맥 중 하나의 분기점을 선택합니다(그림3B, C).참고: E6.5 – E7.5에서, 초리알란토믹 멤브레인은 노른자 정맥에 접근하기 위해 핀셋으로 부드럽게 옆으로 이동해야 할 수도 있습니다. E8.5 이후, 유일한 옵션은 이 단계에 의해, chorioallantoic 막이 완전히 배아를 커버하기 때문에 chorioallantoic 막 정맥 의 하나에 주입하는 것입니다. 두 개의 두 개의 두 #5 개의 두 개의 핀셋을 사용하여 선택한 주입 점 위의 비텔린 멤브레인을 제거하여 반대 방향으로 찢어. Dumont #5 사용하여 당겨진 유리 바늘을 깨고 CellTracker CM-DiI로 적재하기 전에 정맥의 대략적인 크기로 직경을 조정합니다. DMSO의 40 μg/μl에서 DiI 스톡 솔루션을 만들고 -20°C에 보관하십시오. 작업 용액을 0.3 M 자당/PBS로 4 μg/μl 농도로 준비합니다. 입 튜브를 사용하여 바늘로 0.3 M 자당 / PBS에서 DiI의 5 – 10 μl 사이를 흡입합니다. 더 오래된 태아는 25 μl 이상을 요구할 수 있습니다. E8.5에서 배아는 DiI로드 유리 바늘로 찌르기 전에 더 큰, 더 많은 근육 정맥이 #5 위치에 개최될 필요가 있을 지도 모릅니다. 바늘을 정맥에 신속하게 삽입하고 입 튜브로 꾸준히 날려 DiI가 혈전을 형성하지 않고 천천히 혈류에 참여할 수 있도록 합니다. 또는 DiI 전달을 위해 압력 인젝터를 사용하십시오. 8. 단면 또는 전산 검사를위한 배아를 수확 가능한 한 많은 DiI를 배아 내에서 유지하려면, 천공 숟가락에 스쿠핑하고 혈관과 직선 가위 쌍과 결합 조직을 절단하여 주입 직후 배아를 수확하여 노른자에서 배아를 해방하십시오. 느슨한 막을 제거하고 관심기관(즉,이 튜토리얼의폐 및 소화관)을 해부하여 DiI의 확산을 일으키는 조직을 압축하지 않도록 주의를 기울입니다. RT에서 1-2 시간 동안 4 % PFA에 침수하여 조직을 즉시 수정하십시오. PBS에서 5분 동안 조직을 헹구고, PBS에서는 5μg/ml DAPI를 함유합니다. 전체 마운트 검사를 위해 브리지 현미경 슬라이드에 샘플을 장착하거나 냉동 절위를 위해 샘플을 포함시킴이 에 포함시킴이 됩니다.