Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection
Summary
Questo protocollo descrive come produrre funzionale del seno tessuto nodale da cellule murine staminali pluripotenti (PSC). T-box3 (TBX3) sovraespressione più cardiaca miosina pesante catena (MYH6) selezione antibiotica promoter porta a aggregati altamente puri di cellule pacemaker. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") contengono più di 80% di cellule pacemaker, mostrano fortemente aumentato i tassi di battere e sono in grado di camminare miocardio ex vivo.
Abstract
Trattamento della "sindrome del seno malato" si basa su pacemaker artificiali. Questi portano pericoli come guasto della batteria e le infezioni. Inoltre, mancano di ormone reattività e la procedura generale è costosa. "Pacemaker biologico" generati dal PSC possono diventare un'alternativa, ma il contenuto tipico di cellule pacemaker a corpi embrionali (EBS) è estremamente bassa. Il protocollo descritto combina "programmazione in avanti" del PSC murini tramite il nodo del seno induttore TBX3 con la selezione antibiotica a base MYH6-promotore. Questo produce aggregati cardiomiociti coerenti di> 80% cellule pacemaker fisiologicamente funzionali. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") sono spontaneamente contraenti a frequenze ancora non raggiunte (400-500 bpm) corrispondenti alle cellule nodali isolate da cuori di topo e sono in grado di camminare miocardio murine ex vivo. Utilizzando il protocollo descritto seno altamente purosingole cellule nodali possono essere generati, che può essere ad esempio utilizzato per il test della droga in vitro. Inoltre, i iSABs generati in base a questo protocollo può diventare un passo fondamentale verso l'ingegneria dei tessuti del cuore.
Introduction
Il termine "sindrome del seno malato" riassume molteplici malattie che portano al deterioramento del sistema di pacemaker cardiaco. Si compone di patologico, bradicardia sintomatica sinusale, blocco seno-atriale, arresto sinusale e la sindrome di tachicardia-bradicardia. In tal modo, una "sindrome del nodo del seno" è spesso accompagnata da malattie cardiache generali, come cardiopatia ischemica, cardiomiopatia o miocardite. Attualmente, gli approcci terapeutici sono basati sul impianto di pacemaker elettrici. Tuttavia, questo va insieme a una serie di rischi come infezioni e guasto della batteria. Nel complesso, l'incidenza di complicazioni è ancora molto elevato in pazienti che hanno impiantato un pacemaker. Inoltre, al contrario di pacemaker endogena, questi dispositivi non rispondono alla stimolazione ormonale.
Un futuro alternativa può contare sulla disponibilità di "pacemaker biologico" per la quale PSC potrebbero servirecome fonte cellulare adeguato e che sarebbe anche di grande valore per i test anti-droga in vitro. Eppure, un grave problema sta nella rarissima comparsa di cellule nodali del seno entro corpi embrionali (EBS) – questo genere non supera ~ 0.5% 1.
In precedenza, è stato dimostrato che "la programmazione in avanti" verso specifici sottotipi cardiomiociti è fattibile tramite la sovraespressione di diversi primi fattori di trascrizione cardiovascolari, come fattore 1 (MesP1) specifici-posteriore-mesoderma e NK2 trascrizione correlati, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Per dimensioni e la funzione del nodo senoatriale (SAN) normale, la T-box fattore di trascrizione TBX3 è cruciale, che ha dimostrato di avvio del programma di gene pacemaker e controllare differenziazione della SAN 4. Mentre questo migliorato l'aspetto delle cellule pacemaker funzionali, il contenuto ancora non ha superato il 40% ~ all'interno dell'intera popolazione di cellule cardiomyocytic.
Pertanto, una selezione di antibiotico passo basato ulteriore MYH6-promoter 5 è stato introdotto da noi. Questo conduce infine a aggregati cardiomiociti ancora inosservate ("indotte corpi seno-atriale," iSABs ") che presentano altamente aumento delle frequenze battendo (> 400 bpm) in vitro, per la prima volta si avvicinano a quelli di un cuore murino e paragonabile a coltivati in vitro seno cellule nodali isolate da un cuore murino 6. Sotto l'amministrazione Isoprenalina anche frequenze battendo di 550 bpm vengono raggiunti. In particolare, iSABs consistono in oltre l'80% funzionali cellule nodali come evidente dalla vasta fisiologico analisi 7. Recentemente, diversi approcci per la generazione di cellule del seno nodali utilizzando riprogrammazione diretta 19, superficie marcatori 14 o trattamento farmacologico con piccole molecole 16,17 sono stati descritti. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha portato ad una tale elevata purezza delle cellule pacemaker e battendo frequenze vicine alla murino chearte come osservato in iSABs.
Inoltre, in un ex vivo modello coltivati topo adulto fette ventricolari che hanno perso la loro attività battere spontanea, i iSABs sono in grado di integrare nel tessuto fetta, rimanendo così spontaneamente attivo e robusto stimolazione le fette di cuore a contrazioni 7. Un protocollo dettagliato per la generazione di questi iSABs è descritto in questo documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di produrre staminali cellulari derivate cellule pacemaker cardiaco può consentire la ricostituzione del corretto ritmo cardiaco nel senso di "pacemaker biologici". Allo stesso modo, droga test in vitro potranno beneficiare di loro disponibilità. PSC può dare origine a qualsiasi tipo di cellula del corpo dei mammiferi tra cui cardiomiociti con proprietà delle cellule pacemaker 8,9,10,11,12,13. Tuttavia, in genere le popolazioni di cellule all'interno di "corpi embrionali&qu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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