El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em> Cryptococcus neoformans</em

La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo ^1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos "profesional" son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelipodios, que sobresalgan del patógeno y formar un fagosoma ^2. Entre los llamados fagocitos "profesionales" son los macrófagos. Los macrófagos son células altamente especializadas que realizan funciones de protección que incluyen la búsqueda y eliminación de agentes causantes de enfermedades, la reparación de los tejidos dañados, y la mediación de la inflamación, la mayoría deéstos a través del proceso de la fagocitosis ^1,2.

Cryptococcus neoformans es una especie de levadura patógena que causa una enfermedad grave conocida como criptococosis. Cryptococcus esporas son inhaladas por el anfitrión y dan lugar a una infección pulmonar que suele ser asintomática. Se cree que la exposición es muy frecuente; una muestra de 61 niños de las Enfermedades Infecciosas Pediátricas Clínica en el Hospital Centro de Bronx-Lebanon encontró que todos los encuestados tenían anticuerpos contra el polisacárido glucuronoxylomanan criptocócica y otros estudios han demostrado la prevalencia tanto en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) no infectado y adultos infectados ^{3, 4.} Los macrófagos alveolares son la primera línea de la respuesta a la infección pulmonar y en la mayoría de los casos con éxito claro el patógeno. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos (pacientes por ejemplo, VIH y SIDA), la levadura es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos. En estosde los casos, los macrófagos pueden servir como un nicho para la replicación del patógeno y pueden facilitar su difusión en el sistema nervioso central (CNS), donde la enfermedad se vuelve mortal ^5-8. Se cree que los macrófagos pueden incluso ofrecer la levadura directamente en las meninges, ayudando a la levadura para cruzar la barrera de sangre del cerebro a través del modelo "caballo de Troya" ^{3,9 – 11.} Por lo tanto, es importante entender el proceso de fagocitosis y los factores que la afectan, especialmente en infecciones por criptococos.

El trabajo previo en otros sistemas de patógenos apuntan a colesterol y lípidos balsas formadas por colesterol como teniendo un papel importante que desempeñar en la fagocitosis ^12-15. El colesterol es la especie de lípidos más abundantes en las células de mamífero y comprende 25 – 50% de la membrana de células de mamíferos ^16. Se ha encontrado a desempeñar un papel en la modulación de la BIOPpropiedades ÍSICA de membranas cambiando su rigidez ^17. El colesterol y esfingolípidos juntos forman microdominios lipídicos dentro de la membrana conocida como balsas lipídicas. Se ha encontrado que las balsas de lípidos estar involucrado en la formación de caveolas, así como proporcionar un dominio aislado para ciertos tipos de señalización ^16-18. Debido a su pequeño tamaño, es difícil de estudiar las balsas de lípidos in vivo. Una forma útil para estudiar el papel de las balsas lipídicas es alterar sus electores. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) es un compuesto que se ha encontrado para agotar el colesterol de las membranas de mamíferos y se utiliza comúnmente para estudiar el papel de las balsas de lípidos ^18.

En este protocolo, se presenta un método para agotar el colesterol de las membranas de la célula huésped y cuantificar el efecto de la disminución en la capacidad de las células huésped para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimiento hace uso de cultivo celular techniqUES en un macrófago como línea celular inmortalizada (J774A.1) como un modelo para la infección. Agotamiento de colesterol se llevó a cabo por la exposición a MβCD, que tiene un núcleo hidrófobo específico para el tamaño de los esteroles y es capaz de actuar como un sumidero para el colesterol para dibujar hacia fuera de la membrana ^19. Agotamiento de colesterol se midió cuantitativamente usando un kit disponible comercialmente y cualitativamente utilizando una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada seguido por cromatografía en capa fina (TLC) ^20. . La fagocitosis se midió mediante la infección de la línea celular con un cultivo de levadura opsonizado mezclado con un cóctel de interferón-γ y lipopolisacárido para la activación de los macrófagos Cryptococcus se opsonizó utilizando un glucuronoxylomanan (GXM) de anticuerpos ^21-23. Tinción y experimentos de microscopía permitido para la visualización de las células y el cálculo del índice de fagocitosis para evaluar el grado de fagocitosis. En conjunto, este protocolo dEscribes un método básico que integra la alteración de la composición de lípidos con un proceso fisiológico.