Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em> Cryptococcus neoformans</em

Fagocitosi è un processo attraverso il quale entita extracellulari vengono internalizzati dalle cellule ospiti. Si tratta di un'arma fondamentale nell'arsenale del sistema immunitario a difendersi contro gli agenti patogeni, ma il processo può spesso essere sovvertita da agenti patogeni per consentire l'internalizzazione e la diffusione in tutto il corpo ^1. Fagocitosi è mediata da diversi eventi di segnalazione che si traducono in attacco e fagocitazione via riarrangiamenti del citoscheletro della cellula ospite. Fagociti 'professionali' sono in grado di riconoscere e legarsi a opsonine sulla superficie del patogeno invasore di segnalare per l'attacco e la formazione di lamellipodia, che fagocitare l'agente patogeno e formano un phagosome ^2. Tra i cosiddetti fagociti 'professionali' sono i macrofagi. I macrofagi sono cellule altamente specializzate che svolgono funzioni di protezione che includono ricercare e eliminare gli agenti patogeni, riparare tessuti danneggiati, e mediare l'infiammazione, la maggior parte deiquesti attraverso il processo di fagocitosi ^1,2.

Cryptococcus neoformans è una specie di lievito patogeno che provoca una grave malattia nota come Criptococcosi. Spore Cryptococcus inalazione dall'host e determinano un'infezione polmonare che di solito è asintomatica. Si ritiene che l'esposizione è estremamente diffuso; un campione di 61 bambini dalle malattie infettive Pediatric Clinic presso il Centro Ospedaliero Bronx-Lebanon trovato che tutti gli intervistati avevano anticorpi al glucuronoxylomannan polisaccaride criptococcica e altri studi hanno dimostrato la prevalenza sia il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) non infetto e adulti infetti ^{3, 4.} macrofagi alveolari sono la prima linea di risposta all'infezione polmonare e in molti casi con successo chiaro patogeno. Tuttavia, in soggetti immunocompromessi (pazienti ad esempio, HIV e AIDS), il lievito è in grado di sopravvivere all'interno dei macrofagi. In questicasi, i macrofagi possono servire come una nicchia per la replicazione del patogeno e possono facilitare la sua diffusione al sistema nervoso centrale (CNS) se la malattia diventa fatale ^{5 – 8.} Si pensa che i macrofagi possono anche consegnare il lievito direttamente nelle meningi, aiutando il lievito di attraversare la barriera emato-encefalica tramite il modello "cavallo di Troia" ^{3,9 – 11.} Pertanto, è importante comprendere il processo di fagocitosi ed i fattori che incidono su di esso, specialmente nelle infezioni da criptococco.

Impieghi precedenti in altri sistemi patogeni puntare colesterolo e lipidi zattere formate da colesterolo come aventi un ruolo importante da svolgere in fagocitosi ^12-15. Il colesterolo è la specie di lipidi più abbondante in cellule di mammifero e comprende 25 – 50% della membrana cellulare di mammifero ^16. Si è trovato un ruolo nella modulazione della BIOPproprietà hysical di membrane di cambiare la loro rigidità ^17. Colesterolo e sfingolipidi insieme formano microdomini lipidici all'interno della membrana nota come zattere lipidiche. Raft lipidici sono stati trovati ad essere coinvolti nella formazione di caveolae, oltre a fornire un dominio isolato per alcuni tipi di segnalazione ^{16 – 18.} A causa delle loro piccole dimensioni, è difficile studiare zattere lipidiche in vivo. Un modo utile per studiare il ruolo dei raft lipidici è quella di modificare i loro elettori. Metil-β-ciclodestrina (MβCD) è un composto che è stato trovato per esaurire il colesterolo dalle membrane mammiferi ed è comunemente utilizzato per studiare il ruolo dei raft lipidici ^18.

In questo protocollo, presentiamo un metodo per esaurire il colesterolo dalle membrane della cellula ospite e quantificare l'effetto della deplezione sulla capacità delle cellule ospiti di fagocitare C. neoformans in vitro. Questo procedimento si avvale di coltura cellulare techniqUES su un macrofago immortalato come linea cellulare (J774A.1) come modello di infezione. Colesterolo deplezione stato compiuto mediante esposizione a MβCD, che ha un core idrofobico specifica alla dimensione di steroli ed è in grado di agire come un dissipatore per il colesterolo per disegnare fuori della membrana ^19. Colesterolo esaurimento è stata misurata quantitativamente usando un kit disponibile in commercio e qualitativamente con una estrazione del grasso Bligh-Dyer modificato seguita da cromatografia su strato sottile (TLC) ^20. . Fagocitosi è stata misurata infettando la linea cellulare con una cultura di lievito opsonizzati mescolato con un cocktail di interferone-γ e lipopolysaccharide per l'attivazione dei macrofagi Cryptococcus stata opsonizzati utilizzando un anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) ^{21 – 23.} Colorazione e esperimenti di microscopia consentito per la visualizzazione delle cellule e calcolo dell'indice fagocitaria per valutare il grado di fagocitosi. Nel loro insieme, questo protocollo dEscribes un metodo di base che integra l'alterazione della composizione lipidica con un processo fisiologico.