Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em> Cryptococcus neoformans</em

La phagocytose est un processus par lequel les entités extracellulaires sont internalisées par des cellules hôtes. Ce est une arme essentielle dans l'arsenal du système immunitaire à se défendre contre les agents pathogènes, mais le processus peut souvent être subverti par des agents pathogènes pour permettre l'internalisation et la diffusion dans tout le corps ^1. La phagocytose est médiée par plusieurs événements de signalisation qui se traduisent par l'attachement et l'engloutissement par des réarrangements de cytosquelette de la cellule hôte. Phagocytes «professionnel» sont capables de reconnaître et de se lier à opsonines sur la surface de l'agent pathogène envahisseur signaler pour la fixation et la formation de lamellipodes, qui engloutissent l'agent pathogène et former un phagosome ^2. Parmi les phagocytes dits «professionnels» sont des macrophages. Les macrophages sont des cellules hautement spécialisées qui exercent des fonctions de protection qui incluent la recherche et l'élimination des agents pathogènes causant, réparation des tissus endommagés, et médiation de l'inflammation, la plupart desceux-ci par le processus de phagocytose ^1,2.

Cryptococcus neoformans est une espèce de levure pathogène qui provoque une maladie grave appelée cryptococcose. spores de Cryptococcus sont inhalées par l'hôte et entraîner une infection pulmonaire qui est généralement asymptomatique. On pense que l'exposition est extrêmement répandue; un échantillon de 61 enfants des maladies infectieuses pédiatriques Clinique du Centre Hospitalier Bronx-Liban a constaté que toutes les personnes interrogées avaient des anticorps à la glucuronoxylomannan de polysaccharide cryptococcose et d'autres études ont montré la prévalence dans les deux virus de l'immunodéficience humaine (VIH) non infecté et les adultes infectés ^{3, 4.} Les macrophages alvéolaires sont la première ligne de la réponse à l'infection pulmonaire et dans la plupart des cas avec succès clairement l'agent pathogène. Cependant, chez les sujets immunodéprimés (patients, par exemple, le VIH et le sida) la levure est capable de survivre dans les macrophages. Dans ceux-cicas, les macrophages peuvent servir un créneau pour la réplication de l'agent pathogène et peuvent faciliter la diffusion du système nerveux central (SNC) où la maladie devient mortelle ^5-8. On pense que les macrophages peuvent même livrer la levure directement dans les méninges, aider la levure de traverser la barrière hémato-encéphalique via le modèle de «cheval de Troie» ^{3,9 – 11.} Ainsi, il est important de comprendre le processus de phagocytose et les facteurs qui l'affectent, en particulier dans cryptococcoses.

Les travaux antérieurs dans d'autres systèmes de pathogènes pointer vers cholestérol et de lipides radeaux formés par le cholestérol comme ayant un rôle important à jouer dans la phagocytose ^12-15. Le cholestérol est espèces de lipides les plus abondants dans les cellules de mammifère et comprend de 25 à 50% de la membrane ¹⁶ cellulaire de mammifère. Il a été trouvé à jouer un rôle dans la modulation de la BIOPPHYSIQUE propriétés des membranes en changeant leur rigidité ^17. Le cholestérol et sphingolipides forment ensemble microdomaines lipidiques dans la membrane connu comme radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques ont été trouvés à être impliqué dans la formation des cavéoles, ainsi que de fournir un domaine isolé pour certains types de signalisation ^16-18. En raison de leur petite taille, il est difficile d'étudier les radeaux lipidiques in vivo. Une façon utile d'étudier le rôle des radeaux lipidiques est de modifier leurs électeurs. Méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est un composé qui a été trouvé pour réduire le cholestérol des membranes de mammifère et est couramment utilisé pour étudier le rôle des radeaux lipidiques ^18.

Dans ce protocole, on présente un procédé pour réduire le cholestérol des membranes de cellules hôtes et de quantifier l'effet de l'épuisement de la capacité des cellules hôtes à phagocyter C. neoformans in vitro. Cette procédure fait appel à des cultures de cellules techniqUES sur un macrophage immortalisé comme la ligne cellulaire (J774A.1) comme un modèle pour l'infection. Cholestérol épuisement a été accomplie par exposition à MβCD, qui a un coeur hydrophobe spécifique à la taille de stérols et est capable d'agir comme un puits pour le cholestérol de tirer hors de la membrane ^19. Le cholestérol a été mesurée quantitativement épuisement en utilisant un kit disponible dans le commerce et qualitativement en utilisant une extraction lipidique Bligh-Dyer modifié suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) ^20. . La phagocytose a été mesurée en infectant la lignée cellulaire avec une culture de levure opsonisé mélangé avec un cocktail d'interféron-γ et le lipopolysaccharide d'activation des macrophages a été Cryptococcus opsonisé en utilisant un anticorps glucuronoxylomannan (GXM) ^21-23. La coloration et des expériences de microscopie permis pour la visualisation des cellules et le calcul de l'indice phagocytaire pour évaluer le degré de phagocytose. Pris dans leur ensemble, ce protocole dEscribes une méthode de base qui intègre la modification de la composition lipidique avec un processus physiologique.