La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

1. Diferenciación HNSC en Tridimensional Cultura (3D) NOTA: Aislar y derivar hNSCs, a partir de un tejido ético aprobado, descrito en una publicación anterior 2. Por favor, siga los lineamientos éticos e institucionales, mientras que después de este procedimiento. 1.1) Cultura 3D Usando 12 pocillos Placa Utilice una técnica aséptica durante el procedimiento. En una cabina de seguridad biológica, andamios rehidratar añadiendo 2 ml / pocillo de etanol al 70% preparadas utilizando agua para riego (WFIr). Evite tocar los andamios dispensando el etanol al 70% por la pared de cada pozo. Aspirar con cuidado el 70% de etanol y lavar inmediatamente los andamios con 2 ml / pocillo DMEM: F12 durante 1 min. Repita el procedimiento de lavado dos veces. Aspirar con cuidado la DMEM: F12 después del último lavado. Andamios Coat por la adición de 2 ml / pocillo de laminina (10 mg / ml) en DMEM: F12. Incubar la placa a 37 ° C en un CO 2 hum 5%idified incubadora durante un mínimo de 2 horas. Lave la placa con DMEM caliente: F12. Semillas cada andamio con aproximadamente 500.000 hNSCs en un volumen de 150 l de RMM + FG. Incubar la placa durante 3 horas a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5% para permitir que las células se asienten en los andamios. Añadir 3,5 ml de RMM a cada pocillo con cuidado de no desalojar a las células de los andamios. Incubar la placa durante 7 días; reemplazar medio RMM (3,5 ml / pocillo) después de 1 día (primera alimentación) y de nuevo después de 2-3 días a partir de la primera alimentación. Después de 7 días, retire medio y fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) para inmunocitoquímica (CPI) o añadir 500 l / pocillo de reactivo de lisis para la extracción de ARN total (placa de tienda a ≤ -80 ° C o proceder a la extracción de ARN total) . 1.2) Medición de axón resultado de procesos Mancha PFA al 4% fijado hNSCs diferenciadas de acuerdo con un protocolo estándar ICC 20 utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticuerpo primario se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo. Núcleos celulares Contratinción con Hoechst (1 M). Captura de imágenes representativas de las células teñidas-β3 tubulina utilizando un microscopio de fluorescencia; guardar imágenes como tiff o jpeg. Medida del crecimiento de proceso axón mediante una herramienta de medición del software (por ejemplo, Image-Pro Plus). Abra la imagen, seleccione la opción de mediciones en la barra de herramientas y seleccione característica rastro. Para iniciar el rastreo, seleccione el punto de inicio en el axón haciendo clic en el botón del ratón. Seguir la pista a lo largo de toda la longitud de la axón; haga clic derecho para terminar cada traza. Repita para medir todo outgrowthswith axón en el campo de visión. Exprese mediciones como píxeles o micras (pendiente de calibración establecido). Mediciones de la longitud de exportación a un programa de hoja de cálculo para el análisis comparativo y estadístico de la muestra. 2. Mirna expresión usando una Células Madre yLas vías de desarrollo enfocada matriz miARN PCR 2.1) extracción de RNA total miARN Realizar la extracción miRNA en andamios y muestras crecidas 2D (diferenciado e indiferenciado, control HNSC). Descongele los andamios, insertados en una placa de 12 pocillos, si es necesario. Combinar el contenido de reactivo de lisis (500 l) de 2 pocillos en el mismo 1,5 ml tubo Eppendorf, volumen final 1 ml de reactivo de lisis. Tenga cuidado de dejar el andamio en el pozo. Para muestras recogidas previamente como secas celulares se sedimentaron 2D crecido (cultivos HNSC 2D diferenciados y de control indiferenciada) añadir 1 ml de reactivo de lisis y transferir contenido en 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Homogeneizar cada muestra de prueba utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja corta de calibre 20 a 25. Pasar el lisado a través de la aguja utilizando una jeringa de 1 ml hasta 5 veces hasta que se logre un lisado homogénea. Añadir 200 l de cloroformo a cada tubo Eppendorf y tape firmemente. Invertir y tubos de vórtice amezclar el contenido. Centrifugar cada 1,5 ml tubo de microcentrífuga que contiene homogeneizado durante 15 min a ≥12,000 x g. Pasar la fase acuosa superior de cada muestra (evitar la transferencia de cualquier interfase, líquido rosa color) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo que contenía 750 l de etanol al 100%. Mezclar bien por inversión. Pipetear hasta 700 l de cada muestra de prueba, incluyendo cualquier precipitado, en una mini columna en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a ≥8,000 xg durante aproximadamente 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el flujo directo. Repita este paso con el resto de la muestra. Realizar una digerir el ADN durante 15 min. Añadir 700 l RWT tampón a la mini columna y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo. Lave la mini columna añadiendo 500 l de tampón RPE y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo. Repita wash.Centrifuge en ≥12,000 xg durante 1 min para secar la membrana más. Eluir el ARN total en un tubo Eppendorf de 1,5 ml mediante la adición de 40 l de agua libre de RNasa a la mini columna y centrifugación durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir la concentración de ARN total con la ayuda de un espectrofotómetro apropiado. 2.2) miARN Preparación de ADNc Preparar la mezcla maestra de transcripción inversa. Cada muestra requiere 4 l de tampón 5x miScript Hispec, 2 l de 10x energía atómica mezcla, 2 l miScript revertir mezcla transcriptasa. Alícuota 8 l de mezcla maestra en un tubo de PCR, añadir volumen requerido de ARN total (250 ng), y agregue el agua libre de RNasa a un volumen final de 20 l. Incubar durante 60 min a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript de la transcriptasa inversa Mix. Añadir 200 RNasa libre de agua l de cada reacción de 20 l de transcripción inversa, almacenar a -20 ° C, o proceder con verdadero-time PCR inmediatamente. 2.3) Células Madre y las vías de desarrollo Enfocado matriz miARN PCR Preparar los componentes de la mezcla PCR en un tubo de 15 ml mediante la adición de 1.375 l de 2x mezcla maestra SYBR verde, 100 l preparación de ADNc de los genes miARN, 275 l de 10x miScript universal Primer, y 1.000 l de agua libre de RNasa (volumen total de 2.750 l). Transferencia PCR componentes de la mezcla en un depósito de carga PCR. Retire con cuidado el 96 pocillos gama placa de PCR de su envase. Añadir 25 l componentes de la PCR de la mezcla a cada pocillo de la matriz de PCR usando una pipeta de 8 canales, o una pipeta de 12 canales utilizando sólo 8 consejos. Cambie puntas de pipeta después de cada paso de pipeteado para evitar la contaminación cruzada entre los pozos. Sellar la placa con película de adhesivo óptico, y centrifugar durante 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) para eliminar las burbujas. Inspeccione visualmente la placa de debajo para asegurar que no hay burbujas en los pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos matriz de PCR en el termociclador en tiempo real. Programe el tiempo real termociclador en consecuencia: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y 45 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C establece una sola (la recolección de datos de fluorescencia). Exportar los valores de Ct para todos los pozos a una hoja de cálculo de Excel en blanco para su uso con matriz PCR análisis de datos Plantilla Excel y el software basado en la web. NOTA: El software está disponible en www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Análisis Computacional para miARN predicción y validación de objetivos de la meta ARNm por el reportero plásmido transfección y Ddual ensayo de luciferasa. 3.1) Análisis Computacional para la Predicción del miRNA Target Navegar PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, algoritmo disponible en línea para la identificación de miRNA objetivo mRNAs de predicción. Haga clic en "haga clic aquí para la predicción PicTar en los vertebrados". Una nueva página se abrirá. En la nueva página, la interfaz web PicTar, elegir especies en el menú desplegable e introduzca miARN de interés en el cuadro de miRNA ID. Haga clic en la búsqueda de objetivos de un miRNA. Observar una lista de mRNAs objetivo clasificados según su puntuación aPicTar. NOTA: PicTar calcula una puntuación que refleja la probabilidad de que un determinado UTR estará dirigido por el miRNA seleccionado, y se basa en la complementariedad de la semilla, la termodinámica y una predicción combinatoria de objetivos comunes en juegos de co-expresó miRNAs 22. Del mismo modo recuperar la lista de los ARNm diana utilizando DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, y TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternativa en línea disponible algoritmos. Compilar un cuadro comparativo de mIRNAS basado en el ranking obtenido utilizando diferentes herramientas de software. PicTar clasifica por puntuación, DianaLab por la precisión (basado en la relación señal a ruido y una puntuación de precisión para la evaluación de la significación de los resultados predichos), y por TargetScan PCT total (basado en la complementariedad de la semilla, la energía libre termodinámica de la unión, sobre la conservación diferentes especies), véase la Tabla 1. 3.2) Validación de Target ARNm por el reportero plásmido transfección y Dual ensayo de luciferasa. NOTA: 3 'UTR reporteros luciferasa para la validación de ARNm objetivo ha sido descrito previamente 25. La transfección Semilla células HeLa a una densidad de 10 5 células / pocillo en placas de 24 pocillos. Después de 24 horas, co-transfectar células HeLa con 1,5 l de reactivo de transfección y, o bien 100 ng de plásmido NR4A3 3 UTR 'Utror SOX5 3', así como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, y hsa-miR-7-5p y hsa-miR-17-5p para NR4A3 3 'UTR, respectivamente) por pocillo. Pocillos de control cotransfectar con NR4A3 3 'Utror SOX5 3' UTRplasmid y fluorocromo marcado siRNAs control negativo. La transfección de los pocillos de control con fluorocromo etiquetados siRNAs control negativo permite la evaluación de la eficacia de transfección y representa el imitador especificidad se unen miARN 3'UTR. Medición de doble luciferase Actividades Mida actividades luciferasa de luciérnaga y Renilla después de la transfección 24 horas. Retire medio de crecimiento celular. Preparar la solución de trabajo I mediante la adición de 50 l de sustrato I en 10 ml de Solución I; mezclar bien. Añadir 300 l de solución de trabajo que en cada uno de 24 pocillos. Transferir el contenido de cada 24 pocillos en 3 pocillos de una placa blanca 96, 100 l cada uno. Espere 10 minutos y medir luciferasa de luciérnaga en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia. Preparar solut trabajoion II mediante la adición de 50 l de sustrato II en 10 ml de solución II; mezclar bien. Añadir 100 l de solución de trabajo que en cada 96 así que ya contiene 100 l de solución de trabajo I. Espere 10 minutos y medir Renilla luciferasa en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia. Calcular la relación de la luminiscencia de la luciferasa de la luciérnaga de la luciferasa de Renilla.