JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

Нервные стволовые клетки (НСК) способны к самообновлению и дифференцировке в нейроны, астроциты и олигодендроциты в конкретных местных микросреды. Здесь, мы представляем набор методов, используемых для трехмерного (3D) дифференциации и микроРНК анализа клонального человек нервных стволовых клеток (hNSC) линии, в настоящее время в клинических испытаниях инсульта инвалидности (NCT01151124 и NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs были получены с этической, утвержденного в первом триместре коры человеческого плода и условно увековечены с помощью ретровирусов интеграции одной копии С-mycER ТАМ построить. Мы опишем, как измерить процесса аксонов из hNSCs дифференцированных по 3D лесов и, как количественно сопутствующих изменений в экспрессии микроРНК с использованием ПЦР массив. Кроме того, мы проявляем вычислительный анализ с целью выбора Мирна предполагаемых целей. Sox5 и NR4A3 были определены в качестве подходящего микроРНК предполагаемого цели выбран значительно вниз регулироватьD микроРНК в дифференцированных hNSC. Цель проверки Мирна была выполнена на Sox5 и NR4A3 3'UTRs двойным репортер плазмиды трансфекции и двойной люциферазы.

Introduction

Исследования стволовых клеток играет центральную роль в регенеративной медицине, который также охватывает дисциплины тканевой инженерии, развития клеточной биологии, клеточных терапии, генной терапии и биоматериалы (леса и матрицы). Стволовые клетки играют важную роль как в органной ремонта developmentand ткани; понимание того, как стволовые клетки работают имеет решающее значение для разработки новых стволовых клеток процедуры на основе 1. CTX0E03 является клональный, условно увековечены человек нервных стволовых клеток (hNSC) линия 2 изолирован от первого триместра коры человеческого плода. CTX0E03 определил качественные характеристики, которые необходимы для клинического банковской ячейки под надлежащей производственной практики (GMP) 3. HNSCs могут спонтанно дифференцироваться в нейроны, клетки глии, и олигодендроциты и, как было доказано, чтобы улучшить неврологические дефициты при пересадке в модели грызунов ишемии 2,4,5. CTX0E03 hNSCs в настоящее время в клинических испытаниях инсульта disabilность (NCT01151124 6 и NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

МикроРНК имеют средний 22 нуклеотидов в длину и доказано, регулирующих молекул 7, они не кодируют белки, а связать 3 простое нетранслируемой области (3'UTR) мРНК, регулирующие их стабильность и перевод на белках. МикроРНК сообщается участвуют в регуляции ряда клеточных процессов, в том числе развития, пролиферации, дифференцировки и 8. Несколько микроРНК были вовлечены в регуляции судьбы и спецификации нервных стволовых клеток 9.

В двумерном (2D) стандартной среде культуры сложность окружающей среды в естественных условиях не совпадают, и, следовательно, индукция и регулирование hNSC дифференциации не является оптимальным. В естественных условиях, клетки окружены трехмерной (3D) микросреды, составленной друга клетки и внеклеточной лиганды, в том числе многиетипы коллагена, ламинин, и других матричных белков внеклеточного матрикса (ЕСМ). Предыдущие исследования показали, что архитектурный рельеф материалов, имитирующих ЕСМ и их фенотип клеток геометрия влияние и судьбу 10-15. Количество коммерчески доступных 3D каркасов доступны; мы использовали высокопористый полистирол каркас инженерии с хорошо определенной и равномерной архитектуры в толстую мембрану 200 мкм, которое обеспечивает 3D-пространстве, в котором клетки могут проникать и дифференцировать 16-18.

В настоящем документе 2D и 3D дифференциации анализы используются для оценки axonprocess вырост. Кроме того, мы опишем метод для профилирования экспрессии микроРНК клинического линии класса hNSC для дальнейшего расследования микроРНК воздействие на ее дифференциации. Способы, показанные в здесь, основаны на тех, первоначально описанных в 19.

Protocol

1. HNSC дифференциация по трехмерной (3D) культуры ПРИМЕЧАНИЕ: Изолировать и получить hNSCs, с этической утвержденной ткани, описанной в предыдущей публикации 2. Пожалуйста, следуйте этические и организационные принципы, следуя этой процедуры. 1,1) 3D культуры, используя 12-луночный планшет Используйте асептическую технику на протяжении всей процедуры. В кабинете биологической безопасности, регидрировать леса, добавляя 2 мл / лунку 70% этанола приготовлены с использованием воды для орошения (WFIr). Старайтесь не прикасаться строительные леса, раздавая на 70% этанола вниз по стене каждой скважины. Тщательно аспирата 70% этанола и немедленно промойте подмости с 2 мл / лунку DMEM: F12 в течение 1 мин. Повторите процедуру промывания дважды. Тщательно аспирата DMEM: F12 После последней промывки. Coat каркасы, добавив 2 мл / лунку ламинин (10 мкг / мл) в DMEM: F12. Выдержите пластину на 37 ° С в 5% CO 2 гулidified инкубатор в течение как минимум 2 ч. Промывают планшет с теплой DMEM: F12. Семенной каждый эшафот с примерно 500 000 hNSCs в объеме 150 мкл RMM + ФГ. Инкубируйте планшет в течение 3 ч при 37 ° С в 5% CO 2 увлажненный инкубатора позволяют клеткам, чтобы обосноваться в каркасах. Добавить 3,5 мл РММ в каждую лунку заботясь, чтобы не сместить клетки от лесов. Инкубируйте планшет в течение 7 дней; заменить RMM среду (3,5 мл / лунку) через 1 день (первого кормления) и снова через 2-3 дней после первой подкормки. После 7 дней, удалить среднего и исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) для иммуноцитохимии (МУС) или добавить 500 мкл / лунку лизирующего реагента для экстракции суммарной РНК (магазин планшетов при ≤ -80 ° C или перейти к полной экстракции РНК) , 1,2) Измерение Axon процесса вырост Пятно 4% PFA фиксированной дифференцированные hNSCs в соответствии со стандартным протоколом ICC 20 с помощью β3-тубулина (TUBB3) первичное антитело детектировали с флуорохромом конъюгированного второго антитела. Контрастное ядра клеток с Hoechst (1 мкМ). Захват представительства изображения β3-тубулина окрашенных клеток с использованием флуоресцентного микроскопа; Сохранение изображений в качестве TIFF или JPEG. Мера процесса аксонов с помощью инструмента измерения программного обеспечения (например, изображения-Pro Plus). Откройте изображение, выберите измерений опцию в панели инструментов и выберите функцию трассировки. Чтобы начать трассировку, выберите начальную точку на аксонов, нажав на кнопку мыши. Проследите по всей длине аксонов; щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить каждый след. Повторите, чтобы измерять все аксонов outgrowthswith в поле зрения. Экспресс измерения в виде пикселей или мкм (в ожидании калибровки Настройка). Измерения длины экспорта в программе электронных таблиц для образца сравнительного и статистического анализа. 2. Мирна выражение с помощью стволовых клеток иРазвивающие Подготовка Focused микроРНК ПЦР массив 2.1) микроРНК общая добыча РНК Выполните извлечение микроРНК на каркасах и 2D, выращенных образцов (дифференцированы и недифференцированные, контроль hNSC). Оттаивания каркасы, вставляется в 12-луночный планшет, если это необходимо. Зерноуборочный лизиса содержание реагента (500 мкл) 2 скважин в том же 1,5 мл пробирку Эппендорфа, конечный объем 1 мл лизирующего реагента. Позаботьтесь, чтобы оставить на эшафот в скважине. Для ранее собранных в виде сухих клеток осаждали 2D вырос образцов (дифференцированных hNSC 2D культур и недифференцированной контроля) добавить 1 мл реактива для лизиса и передачи содержимого в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Однородный каждого испытуемого образца с использованием 1 мл шприц и короткий 20 до 25 иглы. Пропускают лизата через иглу с помощью 1 мл шприца до 5 раз до получения однородной лизат не будет достигнута. Добавить 200 мкл хлороформа в каждую пробирку Эппендорфа и колпачок надежно. Обратить и вихревые трубки дляперемешать содержимое. Центрифуга друг 1,5 мл микроцентрифужных трубки, содержащей гомогенат в течение 15 мин при ≥12,000 х г. Передача верхней водной фазы каждого образца (во избежание передачи любой интерфазы розового цвета жидкость) в чистую 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 750 мкл 100% -ного этанола. Тщательно перемешайте, переворачивая. Пипетировать до 700 мкл каждого испытуемого образца, в том числе любого осадка, в мини-колонки в 2 мл пробирку. Закрыть крышку и центрифуге при ≥8,000 мкг в течение примерно 30 сек при комнатной температуре. Откажитесь от проточных. Повторите этот шаг, используя оставшуюся часть образца. Выполнение дайджест ДНК в течение 15 мин. Добавить 700 мкл буфера RWT в мини-колонны и центрифуги в течение примерно 30 секунд при ≥8,000 х г. Откажитесь от проточных. Вымойте мини колонки, добавив 500 мкл буфера ПЭС и центрифугирования в течение примерно 30 секунд при ≥8,000 х г. Откажитесь от проточных. Повторите wash.Centrifuge на ≥12,000 мкг в течение 1 мин, чтобы высушить мембрану дальше. Элюции общей РНК в 1,5 мл пробирку Эппендорфа при добавлении 40 мкл РНКазы свободной воды в мини-колонке и центрифугировали в течение 1 мин при ≥8,000 х г. Измерьте общую концентрацию РНК с помощью соответствующего спектрофотометра. 2.2) микроРНК кДНК Подготовка Подготовка обратной транскрипции мастер микс. Каждый образец требует 4 мкл 5х буфера miScript HiSPEC, 2 мкл 10Х nucleics смеси, 2 мкл обратной транскриптазы miScript смеси. Аликвоты 8 мкл мастер смеси в ПЦР-пробирку, добавить необходимый объем общей РНК (250 нг), и добавить РНКазы воду до конечного объема 20 мкл. Инкубируют в течение 60 мин при 37 ° C.Incubate в течение 5 мин при 95 ° С для инактивации обратной транскриптазы miScript Mix. Добавить 200 мкл РНКазы свободной воды для каждой реакции 20 мкл обратной транскрипции, хранить при температуре -20 ° С, или перейти в реальном-тимне сразу ПЦР. 2.3) Стволовые клетки и с развитием Подготовка Focused микроРНК ПЦР массив Подготовка компонентов смеси ПЦР в 15 мл пробирку, добавляя 1375 мкл 2x SYBR зеленый мастер смеси 100 мкл подготовку микроРНК кДНК, 275 мкл 10-кратного miScript Универсальный грунт и 1000 мкл РНКазы свободной воды (общий объем 2750 мкл). Трансфер ПЦР компонентов смеси на погрузочной водохранилища ПЦР. Осторожно снимите блок плиты ПЦР 96-луночного из герметичной сумке. Добавить 25 мкл ПЦР-смеси компонентов в каждую лунку массива ПЦР с использованием пипетки 8-канальный или пипетки на 12 канала с использованием только 8 подсказки. Изменить пипетки советы после каждого раскапывания, чтобы избежать перекрестного загрязнения между скважинами. Уплотнительную пластину с оптическим клейкой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 1000 мкг при комнатной температуре (15-25 ° С), чтобы удалить пузырьки. Осмотрите планшет от внизу, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков присутствуют в скважинах. Поместите 96-луночного планшета ПЦР массив в режиме реального времени циклере. Программа в реальном времени циклер соответственно: 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, и 45 циклов в течение 15 сек при 95 ° С, и 1 мин при 60 ° C установить единый (сбор данных флуоресценции). Экспорт значения Ct для всех скважин на пустой таблицы Excel для использования с ПЦР массив данных анализа шаблонов Excel и веб-программное обеспечение. ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение доступно на www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Компьютерный анализ для микроРНК целевой прогнозирования и проверка мРНК мишеней корреспондента плазмиды трансфекции и Ddual люциферазы. 3.1) Компьютерный анализ для микроРНК целевой прогнозирования Просмотр PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, на сайте доступны алгоритм для идентификации МирNA целевой прогнозирования мРНК. Нажмите на "для PicTar прогноза по позвоночных нажмите здесь". Новая страница откроется. В новой страницы, веб-интерфейс PicTar, выберите вид в раскрывающемся меню и вставьте Мирна интерес в поле микроРНК ID. Нажмите поиск целей микроРНК. Соблюдайте список целевых мРНК, ранжированных по aPicTar счет. ПРИМЕЧАНИЕ: PicTar вычисляет оценку, отражающую вероятность того, что дано УТР будут направлены на выбранной микроРНК, и на основе семян взаимодополняемости, термодинамики и комбинаторной прогнозирования для общих целей в наборах взаимодействующих выразил микроРНК 22. Точно так же получить список целевых мРНК с помощью DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23 и TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, альтернативу на линии доступной алгоритмы. Составьте сравнительную таблицу мiRNAs на основе рейтинга получены с использованием различных программных средств. PicTar занимает по счету, DianaLab по точности (по сигнала к шуму и оценка точности для оценки значимости прогнозируемых результатов), и TargetScan совокупностью РСТ (на основе семян взаимодополняемость, термодинамической свободной энергии связывания, сохранению над разных видов), табл 1. 3.2) Проверка мРНК мишеней корреспондента плазмиды трансфекции и двойной люциферазы. ПРИМЕЧАНИЕ: 3 'UTR люциферазы журналистам для проверки мРНК-мишени было описано ранее 25. Трансфекция Семенной клеток HeLa при плотности 10 5 клеток / лунку в 24-луночного планшета. После 24 ч, со-трансфекции клеток HeLa с 1,5 мкл реагента для трансфекции и либо 100 нг NR4A3 3 "UTRor Sox5 3 'UTR плазмиды, а также 20 нМ микроРНК имитирует (HSA-Мир-96-5p для Sox5 3217; УТР и HSA-Мир-7-5p и HSA-Мир-17-5p для NR4A3 3 'UTR, соответственно) на лунку. Co-трансфекции контрольные лунки с NR4A3 3 'UTRor Sox5 3 "UTRplasmid и флуорохромом помечены миРНК отрицательный контроль. Трансфекции контрольных лунках с флуорохромом помечены негативных миРНК контроля позволяет оценить эффективность трансфекции и составляет мимической микроРНК 3'UTR привязки специфичности. Измерение двойного люциферазы деятельности Измерьте Firefly и Renilla люциферазы мероприятий с 24 ч после трансфекции. Удалить среду роста клеток. Подготовка рабочего раствора I путем добавления 50 мкл субстрата I в 10 мл раствора I; тщательно перемешать. Добавить 300 мкл рабочего раствора я в каждом 24 хорошо. Перенести содержимое каждого 24 и в 3 лунки 96 белой тарелке, 100 мкл каждого из них. Подождите 10 минут и измерить люциферазы светляков в люминометра набор для приобретения люминесценции. Подготовить рабочий Solutиона II, путем добавления 50 мкл субстрата II в 10 мл раствора II; тщательно перемешать. Добавить 100 мкл рабочего раствора I в каждый 96-луночный, уже содержащей 100 мкл рабочего раствора I. Подождите 10 минут и измерить Renilla люциферазы в люминометра набор для приобретения люминесценции. Рассчитать отношение люминесценции от люциферазы светляков к люциферазы Renilla.

Representative Results

На рисунке 1 визуализируется расследование и количественную оценку hNSC дифференциации на 3D лесов по сравнению с традиционными плоской поверхности культур (2D) и expressedas измерения процесс вырост аксонов. На рисунке 2 является representedthe документооборота и результаты для количественного микроРНК с использованием стволовых клеток и пути развития сосредоточены микроРНК ПЦР массив исследовать дифференциальное выражение микроРНК в 2D и 3D дифференцированных hNSCs по сравнению с недифференцированной контроля. После микроРНК сравнительный анализ между дифференцированными и недифференцированными hNSCs и компьютерного анализа для целевой прогнозирования, Sox5 и NR4A3 (NOR1) были определены в качестве предполагаемых целевых мРНК. Для изучения прямого взаимодействия между микроРНК и их предполагаемого участка на 3'UTR мРНК мы использовали 2 коммерчески доступных плазмид, содержащие либо Sox5 или NR4A3 3'UTR последовательность вставлен ниже светлячка гена-репортера люциферазы, й содержащие в одном гена люциферазы плазмиды Renilla для нормализации. Представительные результаты 3 'UTR активности люциферазы понижающей регуляции представлена ​​на рисунке 3. Рисунок 1:. Дифференциация hNSCs на 3D лесов, и измерение Axon процесса эс вырост () Следуя стандартной ICC окрашивание на β3-тубулина (зеленый) и ядер контрастно Hoechst (синий) Представитель микрофотографии были приобретены и измерение аксонов процессы осуществляется с помощью программным обеспечением для анализа изображений. (B) Схемы отчетности измерение процесса аксонов выполненную в 2D и 3D дифференцированных hNSCs для 1 (1 Вт) или 3 недель (3W).COM / файлы / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2:. Схема документооборота Мирна профилирования в дифференцированных hNSCs Всего РНК, в том числе микроРНК, экстрагируют либо из дифференцированных hNSCs на 3D лесов и стандартных 2D культур, или недифференцированного контроля. 250 нг общей РНК были расшифрованы ретро-с методом, который облегчает селективную конверсию зрелых микроРНК в кДНК, пригодной для количественного микроРНК с дифференциацией клеток человека и развития miScript микроРНК ПЦР массива. Гео-среднее SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A и RNU6-2 был использован для анализа данных на основе метода 2 -ΔΔct. Существенные изменения были определены как +/- 1,5 раза вверх и вниз регулирования в ГНАстатистически в значительной степени. Данные были проанализированы с помощью веб-программное обеспечение, доступное на результаты выражены в clustergram. Модифицированная на рисунке 3 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Проверка микроРНК цели предсказал мРНК с помощью двойной люциферазы отчета. (А) представитель схема двойного люциферазы репортера плазмиды, используемой в качестве инструмента для проверки 3'UTR последовательность в непосредственной мишенью микроРНК. (B) Представитель микрофотография, показывающая эффективность трансфекции. (С)   Сигналы, выраженный в виде относительной активности люциферазы, из человеческой 3 & #39; UTR журналисты ofSOX5 и NR4A3 гены были значительно сбил в присутствии HSA-Мир-96, а HSA-Мир-7 и 17 микроРНК имитирует соответственно. Модифицированная на рисунке 5 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. DIANALAB PicTar TargetScan микроРНК Гена-мишени Целевые сайты / гены найдены Точность Гол Совокупный P CT HSA-Мир-96 Sox5 1214/763 1 6,74 <TD> 0,94 HSA-Мир-183 DUSP10 302/190 0,72 4,75 0,85 HSA-Мир-302а NR4A3 863/473 0,84 3.05 NF HSA-Мир-182 FOXN3 1358/794 0,94 NF 0,96 HSA-Мир-7 NR4A3 NF NF 1,61 0,17 HSA-Мир-7 FOXN3 399/136 0,17 NF 0,88 HSA-Мир-20а NR4A3 1650/841 0,85 5,87 0,63 <stronг> HSA-Мир-20b NR4A3 1955/973 0,9 5,87 0,63 HSA-Мир-17 NR4A3 1928/961 0,9 5.38 0,63 + 0,37 HSA-Мир-20а EIF4G3 1650/841 0,97 NF NF HSA-Мир-20b EIF4G3 1955/973 0,94 NF NF HSA-Мир-17 EIF4G3 1928/961 0,94 NF NF Таблица 1: Список микроРНК прогнозирования целевой мРНК. Представитель стол микроРНК, целевой прогнозный гены, и анализ алгоритмов (предсказатьион / оценка / агрегат осуществляется с использованием Диана Lab, PicTar и TargetScan соответственно). Модифицированный из таблицы 3 19.

Discussion

Разработка новых в анализах пробирке для оценки и улучшения дифференциации стволовых клеток всегда представляет собой серьезную проблему для исследования их функциональных возможностей и терапевтических возможностей. Длительное и стабильной крепление hNSCs, необходимое для развития надежной 3D в пробирке дифференциации анализа, выступил тестирования нескольких 3D подложек с различными характеристиками в плане материалов и конструкций. В рамках развития анализа мы также оценивали оптимальную концентрацию клеток посева и определили потребность в каркасы для ламинином покрытием. Хотя наши hNSCs могут спонтанно дифференцироваться от 4-OHT и удаление фактора роста, внедрение системы 3D культуры показали значительное улучшение в их дифференциации возможностей как измеряется аксона процесса выроста по сравнению со стандартными 2D дифференцированы hNSCs.

Для изучения влияния 3D индуцированной differentiation по выражению hNSC микроРНК мы использовали массив ПЦР. По сравнению со стандартным чипом микрочипов ПЦР массив обеспечивает преимущества прямого количественного и проверки микроРНК интересов. Хотя массив ПЦР ограничен в перспективе от общего количества микроРНК в массиве, например здесь меньше, чем 96, то могут быть адаптированы, чтобы включать и микроРНК интересов, в нашем случае сообщалось ранее в развитии стволовых клеток. Выражение пути метаболизма сосредоточены микроРНК был профилированный в 3D и 2D дифференцированных hNSCs по сравнению с недифференцированных hNSCs. Наиболее значительно вниз регулируется микроРНК были отобраны и проанализированы, чтобы оценить их предполагаемых целевых мРНК с целью определения их функциональность и биологической интерпретации с помощью онлайн имеющиеся алгоритмы (DIANA лаборатории, PicTar и TargetScans).

Один микроРНК может распознать сотни целей и по этой причине мы утверждена микроРНК взаимодействия с 3 'UTR mRNAsthat может быть подходящими кандидатами вxonal регулирования. NR4A3, цель ЧСА-Мир-7, и Мир-17 семьи, является членом NR4A семьи ядерными рецепторами, которые, в зависимости от их уровня экспрессии, участвуют в дифференцировке, выживание, апоптоз и регулирования гиппокампа аксона руководство 26. Точно так же Sox5, цель HSA-Мир-96, сообщает контролировать прогрессию клеточного цикла в нейронных клеток-предшественников 27 длина аксона 28, миграции, после миграционный дифференциации, и, по прогнозам нейронов 29. И Sox5 и NR4A3 были определены в качестве прямого целевой мРНК HSA-Мир-96, а HSA-Мир-7 и 17, соответственно, двумя люциферазы анализов. Двойной люциферазы (Firefly и Renilla) основывается на двух разных генов-репортеров, в том же плазмиды и предлагает улучшенную систему, позволяющую нормализация для эффектов, вызванных неоптимальной трансфекции и цитотоксических эффектов по сравнению с одним люциферазы системы плазмид. В рамках нашего развития анализа мы также оптимизировали трансфекции conditiДополнения, чтобы получить высокую эффективность.

Protocolsdescribed данном документе, могут быть использованы для дальнейшей оптимизации и характеризуют в пробирке hNSC дифференциация, которая может beimplemented протоколы intransplantation для доклинических исследований и будущих клинических приложений.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем, Джули Хьюард за помощь в подготовке hNSCs и Lavaniya Thanabalasundaram за техническую поддержку с HeLa культивирования и трансфекции.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3’UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

Human Neural Stem Cells3D CultureDifferentiationMicroRNATarget GenesSOX5NR4A3Axon OutgrowthMiRNA ExpressionComputational AnalysisDual Luciferase Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image