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Biologie du développement

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

Neurale Stammzellen (NSCs) sind in der Lage, Selbsterneuerung und Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten unter spezifischen lokalen Mikroumgebungen. Im hier präsentieren wir eine Reihe von für die dreidimensionale (3D) Differenzierung und miRNA-Analyse einer klonalen humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behinderung (NCT01151124 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov) verwendet, Methoden. HNSCs wurden aus ethischer genehmigten ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex abgeleitet und Verwendung von retroviralen Integration einer einzigen Kopie der c-mycER TAM konstruieren bedingt verewigt. Wir beschreiben, wie Axon Prozess Auswuchs hNSCs auf 3D-Gerüsten und wie man damit verbundenen Änderungen der miRNA-Expression mit Hilfe der PCR-Array zu quantifizieren differenziert messen. Außerdem veranschaulichen wir Computeranalyse mit dem Ziel, die Auswahl miRNA mutmaßlichen Ziele. SOX5 und NR4A3 wurden als geeignet miRNA vermeintlichen Ziel deutlich ausgewählt identifiziert herunterregulierend miRNAs in differenzierten HNSC. MiRNA-Target-Validierung wurde am SOX5 und NR4A3 3'UTRs von Dual-Reporter-Plasmid-Transfektion und Dual-Luciferase-Assay durchgeführt.

Introduction

Stammzellforschung spielt eine zentrale Rolle in der regenerativen Medizin, die auch umfasst die Disziplinen des Tissue Engineering, Entwicklungs Zellbiologie, Zelltherapeutika, Gentherapie und Biomaterialien (Gerüsten und Matrizen). Stammzellen sind in beiden Organ Entwicklungund Gewebereparatur wichtig; zu verstehen, wie Stammzellen funktionieren ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung neuer Stammzell-basierten Behandlungen ein. CTX0E03 ist eine klonale, konditional immortalisierten humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie 2 vom ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex isoliert. CTX0E03 hat Qualitätsmerkmale, die für die klinische Zellbank unter guten Herstellungspraxis (GMP) 3 definiert. HNSCs kann spontan in Nervenzellen, Gliazellen und Oligodendrozyten differenzieren und haben sich als neurologische Defizite zu verbessern, wenn in einem Nagetiermodell der fokalen Ischämie 2,4,5 transplantiert. Die CTX0E03 hNSCs sind derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behindekeit (NCT01151124 6 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNAs eine durchschnittliche 22 Nukleotide lang und regulatorische Moleküle 7 bewiesen, sie kodieren Proteine, sondern binden 3 Prime-untranslatierten Region (3'-UTR) von mRNAs, die Regulierung ihrer Stabilität und Übersetzung in Proteine. MiRNAs sind bekannt, die zur Regelung einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung 8 teilzunehmen. Mehrere miRNAs sind bei der Regulierung des Schicksals und Spezifikation von neuralen Stammzellen 9 in Verbindung gebracht.

In zweidimensionalen (2D) Standardkulturumgebung der Komplexität der in vivo-Umgebung nicht übereinstimmen und folglich der Induktion und Regulation der Differenzierung HNSC nicht optimal ist. In vivo werden die Zellen durch eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung von anderen zusammen umgeben Zellen und extrazellulärer Liganden, darunter auch vieleTypen von Kollagenen, Laminin und andere Matrixproteine ​​(der extrazellulären Matrix, ECM). Frühere Studien haben berichtet, dass die architektonischen Topographie der Materialien nachahmt ECMs und deren Geometrie beeinflusst Zellphänotyps und Verbleib 10-15. Eine Anzahl von im Handel erhältlichen 3D Gerüste zur Verfügung stehen; Wir verwendeten ein hochporöses Polystyrol-Gerüst mit einer gut definierten und einheitlichen Architektur entworfen in eine 200 um dicke Membran, die ein 3D-Raum in die Zellen eindringen können und differen 16-18 liefert.

Hierin 2D- und 3D-Differenzierungsassays werden zur axonprocess Auswuchs zu bewerten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um die miRNA-Expression einer klinischen Grade HNSC Linie Profil zu miRNA Auswirkungen auf die Differenzierung weiter zu untersuchen. Die Methoden hier dargestellt sind auf die, die ursprünglich in 19 beschrieben basiert.

Protocol

1. HNSC Differenzierung Dreidimensional (3D) Kultur HINWEIS: Trennen Sie und leiten hNSCs, aus ethischer genehmigt Gewebe, in einer früheren Veröffentlichung 2 beschrieben. Bitte beachten Sie die ethischen und institutionellen Richtlinien während des folgenden Verfahrens. 1.1) 3D Culture Mit 12-Well-Platte Verwenden Sie aseptische Technik während des gesamten Verfahrens. In einer biologischen Sicherheitswerkbank, die mit Wasser bewässert (WFIR) rehydratisieren Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von 70% Ethanol hergestellt. Berühren Sie nicht die Gerüste durch den Verzicht auf die 70% Ethanol auf der Wand jedes gut. Die 70% Ethanol vorsichtig absaugen und sofort abwaschen die Gerüste mit 2 ml / Vertiefung DMEM: F12 für 1 min. Zweimal wiederholen den Waschvorgang. Sorgfältig absaugen DMEM: F12 nach dem letzten Waschen. Coat Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von Laminin (10 ug / ml) in DMEM: F12. Inkubieren Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Brummenidified Inkubator für ein Minimum von 2 Stunden. Waschplatte mit warmem DMEM: F12. Saatgut jedes Gerüst mit etwa 500.000 hNSCs in einem Volumen von 150 ul RMM + GF. Inkubiere die Platte für 3 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator, sodass die Zellen, in die Gerüste zu regeln. Fügen Sie 3,5 ml RMM in jede Vertiefung kümmert sich nicht um Zellen von Gerüsten zu entfernen. Inkubieren der Platte für 7 Tage; ersetzen RMM Medium (3,5 ml / Vertiefung) nach 1 Tag (erste Fütterung) und wieder nach 2-3 Tagen aus der ersten Fütterung. Nach 7 Tagen entfernen Medium und fixieren die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für Immunzytochemie (ICC) oder fügen Sie 500 ul / Vertiefung Lysereagenz für Gesamt-RNA-Extraktion (store Platte bei ≤ -80 ° C oder fahren Sie mit der Gesamt-RNA-Extraktion) . 1.2) Messung der Axon-Prozess Auswuchs Fleck 4% PFA fixiert differenzierte hNSCs nach einer Standard-ICC-Protokoll 20 mit β3-Tubulin (TUBB3) mit einem Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen primären Antikörper. Gegenfärbung Zellkerne mit Hoechst (1 uM). Erfassung repräsentativer Bilder von β3-Tubulin-gefärbten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops; Bilder als TIFF- oder JPEG speichern. Maß für Axon Prozess Auswuchs mit einem Software-Messinstrument (zB Image-Pro Plus). Öffnen Sie das Bild, wählen Sie die Option Messungen in der Werkzeugleiste und wählen Sie Trace-Funktion. Um den Trace zu starten, wählen Sie den Startpunkt auf dem Axon Auswuchs, indem Sie die Maustaste los. Spur entlang der gesamten Länge des Axon-Auswuchs; der rechten Maustaste, um jede Spur zu beenden. Wiederholen Sie alle Axon outgrowthswith in das Blickfeld zu messen. Express-Messungen als Pixel oder um (ausstehende Kalibrierung einrichten). Export Längenmessungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm für die Proben vergleichende und statistische Analyse. 2. miRNA-Expressions Verwenden einer Stammzellen undEntwicklungswege Focused miRNA PCR Array 2.1) miRNA Gesamt-RNA-Extraktion Führen miRNA Extraktion auf Gerüsten und 2D gewachsen Proben (differenzierte und undifferenzierte, HNSC Steuerung). Tau-Gerüste, in einem 12-Well-Platte eingesetzt wird, falls erforderlich. Kombinieren Lysereagenz Inhalt (500 ul) von 2 Vertiefungen in der gleichen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Endvolumen 1 ml Lysis-Reagens. Darauf achten, dass das Gerüst in der gut zu verlassen. Für zuvor gesammelten als Trockenzellenpelle 2D gewachsen Proben (differenzierte HNSC 2D Kulturen und undifferenzierte Steuer) 1 ml Lyse-Reagenz und Inhalt in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie jede Probe mit einer 1-ml-Spritze und eine kurze 20 bis 25 Gauge-Nadel. Führen Sie das Lysat durch die Nadel mit einer 1 ml Spritze bis zu 5 Mal, bis ein homogenes Lysat erreicht. Fügen Sie 200 ul Chloroform zu jedem Eppendorf-Röhrchen und Kappe fest. Umkehren und Wirbelrohre zummischen Inhalten. Zentrifuge je 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das Homogenat 15 Minuten lang bei ≥12,000 x g. Wird die obere wässrige Phase von jeder Probe (zur Vermeidung der Übertragung jedes der Interrosafarbene Flüssigkeit) in ein frisches 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 750 & mgr; l 100% Ethanol. Gründlich mischen durch Umdrehen. Pipettieren von bis zu 700 & mgr; l jeder Testprobe, einschließlich der Niederschlag, der in einen Mini-Säule in ein 2-ml-Collection-Tube. Schließen des Deckels und Zentrifuge bei ≥8,000 xg für etwa 30 sec bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen dieser Schritt unter Verwendung der Rest der Probe. Durchführen einer DNA-Digest für 15 min. Fügen Sie 700 ul Puffer RWT an den Mini-Säule und zentrifugieren Sie für ca. 30 Sekunden bei ≥8,000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Durch Zugabe von 500 & mgr; l Puffer RPE und Zentrifugation für etwa 30 Sekunden bei ≥8,000 x g waschen Mini Spalte. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen wash.Centrifuge bei ≥12,000 · g für 1 min, um die Membran weiter zu trocknen. Eluieren Gesamt-RNA in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen durch Zugabe von 40 & mgr; l RNase-freies Wasser auf die Mini-Säule und Zentrifugieren für 1 min bei ≥8,000 x g. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit Hilfe eines geeigneten Spektralphotometer. 2.2) miRNA cDNA Vorbereitung Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Master-Mix. Jede Probe erfordert 4 ul 5x miScript HiSpec Puffer, 2 ul 10x nucleics Mix miScript 2 ul-Reverse-Transkriptase-Mix. Aliquoten 8 ul der Master-Mix in einem PCR-Röhrchen, fügen erforderliche Volumen von Gesamt-RNA (250 ng), und fügen Sie RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. Inkubieren für 60 min bei 37 ° C.Incubate für 5 min bei 95 ° C bis miScript Reverse Transcriptase-Mischung zu inaktivieren. Fügen Sie 200 ul RNase-freies Wasser zu je 20 ul Reverse-Transkriptions-Reaktion, bei -20 ° C, oder fahren Sie mit Echt timich sofort PCR. 2.3) Stammzellen und Entwicklungswege Focused miRNA PCR Array Die PCR-Komponenten-Mix in einem 15-ml-Röhrchen durch Zugabe von 1375 ul 2x SYBR Green Master Mix, 100 ul miRNA cDNA-Präparation, 275 ul von 10x miScript Universalgrundierung, und 1000 ul RNase-freies Wasser (Gesamtvolumen 2750 ul). Übertragen PCR-Komponenten-Mix auf einem PCR-Ladebehälter. Die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array aus der versiegelten Beutel vorsichtig entfernen. In 25 ul PCR-Komponenten Mischung in jede Vertiefung der PCR-Array mit einem 8-Kanal-Pipette oder ein 12-Kanal-Pipette mit nur 8 Tipps. Ändern Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Dichtungsplatte mit optischer Klebefolie und zentrifugieren für 1 min bei 1000 xg bei Raumtemperatur (15-25 ° C), um Luftblasen zu entfernen. Sichtprüfung der Platte von unten, um sicherzustellen, keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array in der Echtzeit-Cycler. Programmieren Sie die Echtzeit-Cycler entsprechend: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min und 45 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C einen einheitlichen (Fluoreszenz-Datenerfassung). Exportieren Sie die Ct-Werte für alle Vertiefungen auf eine leere Excel-Tabelle für die Verwendung mit PCR-Array Datenanalyse Vorlage Excel und Web-basierte Software. HINWEIS: Software ist verfügbar www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Vorhersage und Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions und Ddual Luciferase Assay. 3.1) Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Prediction Durchsuchen PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, online verfügbar Algorithmus zur Identifizierung von miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. Klicken Sie auf "Klicken Sie hier, PicTar Vorhersage von Wirbeltieren". Eine neue Seite wird geöffnet. In der neuen Seite, PicTar Web-Interface, wählen Arten in dem Dropdown-Menü und legen miRNA von Interesse in der miRNA-ID ein. Klicken Sie auf der Suche nach Zielen eines miRNA. Beachten Sie die Liste der Ziel-mRNAs durch aPicTar Punktzahl rangiert. HINWEIS: PicTar berechnet eine Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein gegebenes UTR durch die ausgewählte miRNA richtet werden, und basierend auf Saatgut Komplementarität Thermodynamik und einer kombi Vorhersage für übliche Ziele in Sätzen von coexprimiert miRNAs 22. Verwendung DIANA-LAB (Ähnlich abrufen Liste der Ziel-mRNAs http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23 und Targetscan ( http://www.targetscan.org/ ) 24. Alternative online verfügbar Algorithmen. Erstellen Sie eine Vergleichstabelle der miRNAs Basis Ranking unter Verwendung von verschiedenen Software-Tools. PicTar rangiert nach Punkten, DianaLab durch Präzision (basierend auf den Signal-Rauschabstand und einem Präzisions-Score zur Beurteilung der Bedeutung der erwarteten Ergebnisse) und Targetscan von aggregierten PCT (basierend auf Saatgut Komplementarität, thermodynamischen freien Bindungsenergie, die Erhaltung über verschiedene Arten), siehe Tabelle 1. 3.2) Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions-und Dual-Luciferase Assay. HINWEIS: 3'UTR Luciferase Reporter für die Validierung der Ziel-mRNA wurde zuvor beschrieben 25. Transfektion Seed HeLa-Zellen bei einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in 24-Well-Platte. Nach 24 Stunden, Co-Transfektion von HeLa-Zellen mit 1,5 ul Transfektionsreagenz und entweder 100 ng NR4A3 3 'UTRor SOX5 3'-UTR-Plasmid sowie 20 nM miRNA imitiert (hsa-miR-96-5p für SOX5 3217; UTR und hsa-miR-7-5p und hsa-miR-17-5p für NR4A3 3'UTR beziehungsweise) pro Vertiefung. Co-Transfektion von Kontrollvertiefungen mit NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid und Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs. Die Transfektion von Kontrollvertiefungen mit Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs ermöglicht Auswertung der Transfektionseffizienz und macht Mimik miRNA 3'UTR bind Spezifität. Die Messung der Dual-Luciferase-Aktivitäten Messen Sie Firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten 24 h nach der Transfektion. Entfernen Zellwachstumsmedium. Bereiten Sie Arbeitslösung I durch Zugabe von 50 ul Substrat I in 10 ml Lösung I; gründlich mischen. Fügen Sie 300 ul der Arbeitslösung I in jedes 24-Loch. Übertragen Sie den Inhalt jeder 24 gut in 3 Wells einer 96 weiße Platte wurden 100 ul jeder. Warten Sie 10 min und messen Firefly Luziferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. Bereiten Sie Arbeits solutIonen II durch Zugabe von 50 ul Substrat II in 10 ml Lösung II; gründlich mischen. 100 l Arbeitslösung I in jedes 96-Loch bereits 100 ul der Arbeitslösung, die I. Warten Sie 10 min und messen Renilla-Luciferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. Berechnen des Verhältnisses der Lumineszenz von der Firefly-Luciferase, um die Renilla-Luziferase.

Representative Results

In Abbildung 1 ist die Untersuchung und Quantifizierung von HNSC Differenzierung auf 3D-Gerüsten im Vergleich zu herkömmlichen flachen Oberfläche Kulturen (2D) visualisiert und expressedas Axons Prozess Auswuchs Messungen. In Abbildung 2 ist representedthe Workflow und die Ergebnisse für die miRNA-Quantifizierung mit Stammzellen und Entwicklungswege konzentriert miRNA PCR-Array unterschiedliche Expression von miRNAs in 2D und 3D differenzierte hNSCs Vergleich zu undifferenzierten Kontrolle zu untersuchen. Nach miRNA vergleichende Analyse zwischen differenzierte und undifferenzierte hNSCs und Computeranalyse zur Zielvorhersage, SOX5 und NR4A3 (NOR1) wurden als vermeintliche Ziel-mRNAs identifiziert. Um die direkte Interaktion zwischen den miRNAs und deren vermeintlichen Ort auf der mRNA 3'UTR verwendeten wir zwei im Handel erhältlichen Plasmiden, die entweder SOX5 oder NR4A3 3'UTR-Sequenz eingefügt hinter der Glühwürmchen-Luciferase-Reportergens, studieren ein nd in einem gemeinsamen Plasmid Renilla-Luciferase-Gen für die Normierung. Die repräsentativen Ergebnisse der 3 'UTR Luciferaseaktivität Herunterregulierung ist in Abbildung 3 dargestellt. Abb. 1: Die Differenzierung der hNSCs auf 3D-Gerüste, und die Bewertung von Axons Prozess es Auswuchs (A) Im Anschluss an Standard-ICC-Färbung für β3-Tubulin (grün) und Kerne mit Hoechst (blau) repräsentative Mikrogegengefärbt wurden erworben und Messung von Prozessen gab Axon mit Hilfe einer Bildanalyse-Software durchgeführt. (B) Diagramme die Berichterstattung über die Messung des Axons Prozess Auswuchs in 2D und 3D unterschieden hNSCs 1 (1W) oder 3 Wochen (3W) durchgeführt.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abb. 2: Schematische Workflow von miRNA-Profiling in differenzierten hNSCs Gesamt-RNA, einschließlich miRNAs wurde von beiden differenzierten hNSCs auf 3D-Gerüsten und Standard-2D-Kulturen oder undifferenzierte Steuer extrahiert. 250 ng Gesamt-RNA wurden retro transkribiert mit einer Methode, die die selektive Umwandlung von reifen miRNAs in cDNA für miRNA Quantifizierung mit menschlichen Zelldifferenzierung und Entwicklung miScript miRNA PCR-Array ermöglicht. Die geo-Mittelwert SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A und RNU6-2 wurde zur Datenanalyse auf der Basis der 2 -ΔΔct Methode verwendet. Wesentliche Veränderungen wurden als +/- 1,5 fache nach oben und unten Regelung auf eine sta definierttistically erheblichem Maße. Die Daten wurden mittels web-basierte Software verfügbar Die Ergebnisse sind als clustergram ausgedrückt analysiert. Geändert von 3 19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 3: Validierung von miRNA Ziel prognostiziert mRNA mit einem Dual-Luciferase-Assay-Bericht. (A) Vertreter Diagramm eines Dual-Luciferase-Reporter-Plasmid als Werkzeug benutzt, um 3'-UTR-Sequenz als direktes Ziel einer miRNA validieren. (B) Vertreter mikroskopische Aufnahme, die Transfektionseffizienz. (C)   Signale, ausgedrückt in relativen Luciferase-Aktivität, aus menschlichem 3 & #39; UTR Reportern ofSOX5 und NR4A3 Gene signifikant niedergeschlagen in Gegenwart von hsa-miR-96 und hsa-miR-7 und 17 miRNA imitiert auf. Geändert von 5 19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. DIANALAB PicTar Targetscan miRNA Zielgens Zielorte / Gene gefunden Genauigkeit Ergebnis Aggregate P CT hsa-miR-96 SOX5 1214/763 1 6,74 <td> 0,94 hsa-miR-183 DUSP10 302/190 0.72 4,75 0.85 hsa-miR-302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF hsa-miR-182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0.96 hsa-miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0,17 hsa-miR-7 FOXN3 399/136 0,17 NF 0.88 hsa-miR-20a NR4A3 1650/841 0.85 5,87 0.63 <strong> hsa-miR-20b NR4A3 1955/973 0.9 5,87 0.63 hsa-miR-17 NR4A3 1928/961 0.9 5,38 0,63 + 0,37 hsa-miR-20a EIF4G3 1650/841 0.97 NF NF hsa-miR-20b EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF hsa-miR-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF Tabelle 1: Liste der miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. Vertreter Tabelle von miRNAs, Zielvorhersage Gene und Algorithmen-Analyse (vorherzusagenion / Partitur / Aggregat versehen mit Diana Lab, PicTar und Targetscan beziehungsweise). Geändert aus der Tabelle 3 19.

Discussion

Die Entwicklung neuer in vitro-Tests zur Bewertung und Verbesserung der Differenzierung von Stammzellen ist seit jeher für die Untersuchung ihrer Funktionen und therapeutische Fähigkeiten eine Herausforderung. Langfristige und stabile Befestigung hNSCs, für die Entwicklung eines robusten 3D in vitro Differenzierungstest erforderlich ist, wurde durch Testen mehrerer 3D-Substrate mit verschiedenen Eigenschaften in der Bezeichnung von Materialien und Strukturen gerichtet. Im Rahmen der Assay-Entwicklung haben wir ebenfalls bewertet optimale Zellaussaat Konzentration und identifiziert die Anforderung für die Gerüste an Laminin beschichtet werden. Obwohl unsere hNSCs kann spontan bei differen 4-OHT und Wachstumsfaktor Entfernung, die Durchführung einer 3D-Kultursystem zeigte eine signifikante Verbesserung in ihrer Differenzierungsfähigkeit wie durch Axon-Auswuchs Verfahren gemessen im Vergleich zu Standard-2D-differen hNSCs.

Um die Wirkung der 3D-induzierten differe untersuchenntiation auf HNSC miRNA-Expression verwendeten wir eine PCR-Array. Im Vergleich zu Standard-Chip-Microarray-PCR-Array bietet die Vorteile einer direkten Quantifizierung und Validierung der miRNA von Interesse. Obwohl das PCR-Array wird im Ausdruck der Gesamtzahl der miRNA pro Array, beispielsweise in hier weniger als 96 beschränkt, es kann so zugeschnitten werden, umfassen spezifisch miRNAs von Interesse, in unserem Fall bereits in der Stammzellentwicklung berichtet. Die Expression des Weges fokussiert miRNAs wurde in 3D- und 2D-differen hNSCs Profil verglichen mit undifferenzierten hNSCs. Die signifikant herunterreguliert miRNAs wurden ausgewählt und analysiert, um ihre mutmaßlichen Ziel-mRNAs mit der Absicht der Bestimmung ihrer Funktionalität und biologische Interpretation mit Online-Algorithmen (DIANA Lab PicTar und TargetScans) beurteilen.

Eine einzelne miRNA kann Hunderte von Zielen erkannt und aus diesem Grund haben wir überprüft miRNA Interaktionen mit 3'UTR mRNAsthat können geeignete Kandidaten in einem seinxonal Regulierung. NR4A3, ein Ziel der hsa-miR-7 und miR-17-Familie, ist ein Mitglied der Familie NR4A Kernrezeptoren, die, je nach dem Grad des Ausdrucks, in der Differenzierung, Überleben, Apoptose und Regulierung der Hippocampus beteiligt Axon Führung 26. Ähnlich SOX5, ein Ziel von HSA-miR-96, wird berichtet, dass der Zellzyklusprogression in der neuralen Vorläuferzellen 27 Axonlänge 28, Migration, Differenzierung nach der Migration, und die Vorsprünge von Neuronen 29 steuern. Sowohl SOX5 und NR4A3 wurden als direkte Ziel-mRNA von hsa-miR-96 hsa-miR-7 und 17 jeweils durch Dual-Luciferase-Reporter-Assays identifiziert werden, und. Dual-Luciferase (Firefly und Renilla) stützt sich auf zwei verschiedenen Reportergenen in demselben Plasmid und bietet ein verbessertes System ermöglicht Normalisierung für Auswirkungen durch suboptimale Transfektion und zytotoxische Wirkung gegenüber einer einzigen Luciferase-Plasmid-System verursacht. Im Rahmen unseres Assay-Entwicklung wir auch unsere Transfektion conditi optimiertons, um einen hohen Wirkungsgrad zu erzielen.

Die protocolsdescribed hier kann genutzt werden, um weiter zu optimieren und zu charakterisieren, in vitro Differenzierung HNSC die für präklinische Studien und zukünftige klinische Anwendungen implementiert werden können intransplantation Protokolle.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir erkennen an, Julie Heward für die Hilfe bei der Vorbereitung der hNSCs und Lavaniya Thanabalasundaram für ihre technische Unterstützung mit HeLa Züchtung und Transfektion.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
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References

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Human Neural Stem Cells3D CultureDifferentiationMicroRNATarget GenesSOX5NR4A3Axon OutgrowthMiRNA ExpressionComputational AnalysisDual Luciferase Assay

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Citer Cet Article
Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
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