ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שנערכו בהתאם לועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC), ואושרו בהסכם עם הנחיות משרד פן בריטניה (http://goo.gl/FLkirW, גישה 10 ביוני האחרון , 2014) והצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר Vision (http://goo.gl/4LFOjD, הגישה האחרונה 10 ביוני, 2014). 1. Ocular Hypertension אינדוקציה לגרום לגלאוקומה ניסיונית על ידי הרמת לחץ התוך עיני (IOP) באמצעות הזרקה חד-צדדית של microspheres פאראמגנטיים לתוך התא הקדמי של חולדות בראון נורבגיה, המבוסס על השיטה של et al Samsel. 3 חולדות פיגמנט אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי אלה היו צריכים להיות מאומתים ראשון על ידי המשתמש. נקבת g 250-300 הביתחולדות לשעבר מגדל בראון נורבגיה במתמדת תאורה נמוכה סביבה (40-60 סוויטה דה לוקס) כדי למזער את התנודות יומי בלחץ התוך העיני 7, עם גישה כלרצונך מזון ומים. לקחת מידות IOP בסיסיות בבעלי חיים ער 8 לפני ההרדמה והזרקת חרוז, באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. IOP הוא נלקח כממוצע של חמש קריאות. לטשטש חולדות עם 37.5 מ"ג / קילוגרם קטמין, ו0.25 מ"ג / קילוגרם medetomidine hydrochloride נמסר intraperitoneally. לאשר עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקסים הרגל האחורית של החיה, לפני Povidone יישום יוד (ראה שלב 1.5), והזרקת חרוז (ראה שלב 1.8). לנהל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. הערה: אל להרחיב את התלמיד בכל שלב. זה יעזור לי חרוזים להתיישב טובים יותר לזווית iridocorneal, ולמנוע מחייבים את העדשה. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית בעין הנגדית המופעל un. Wאפר עין האופרטיבית עם 5% יוד povidone במים 10 דקות 5 לפני הזריקה. לאחר 5 דקות, פתיל יוד povidone את השימוש בגזה סטרילית, ולשטוף את העיניים עם 0.9% תמיסת מלח סטרילית. שמור את העיניים לחות במהלך הרדמה עם יישום רגיל של תמיסת מלח סטרילית. מניחים מגנט טבעתי סביב העין. הזרק 25 μl של תמיסה המכילה 30 מ"ג / מיליליטר של גמא-הקרנה מעוקרת 8 מיקרומטר microspheres המגנטי בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ללשכה הקדמית, באמצעות מחט משופעת 33 G. להכין חרוזים, לשטוף מחדש על ידי מתלים, אז צנטריפוגה 3 פעמים ב10,000 XG למשך 5 דקות עם 1 מיליליטר HBSS, לפני קבלת 30 מ"ג / מיליליטר הפתרון הסופי. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל דרך. להזרקה, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת המחט לאיריס, כדי למזער את הסיכון של טראומת קשתית. זה ניתן למנוע על ידי orientating המחט משיקה למשטח קרני, כמקביל לאיריס ככל האפשר. זה גם יעזור לי כדי להקטין את איבוד חרוז מאתר ההזרקה. הערה: הזרק חרוזים בקצב מהיר כדי להבטיח חלוקה שווה סביב זווית iridocorneal, שהוא קריטי להעלאת לחץ תוך עיני. בנוסף, חרוזים חנות, מחטים וטבעות מגנטיות בנפרד, כך שהחרוזים לא יוצרים אשכולות, מה שהופך אותם קשה לטעון לתוך המזרק ולהזריק, והמחט אינה הופכת להיות ממוגנטת. השאר את המחט במקום 1 דקות לאחר הזרקה על מנת להבטיח כי חרוזים להתיישב לתוך זווית iridocorneal לעכב ניקוז המימי מmeshwork trabecular. מעט זווית המחט לאחר חרוזים יש בתחילה התיישבה כדי לאפשר זליגה מסוימת של מימית, כדי למזער את העלייה חולפת בלחץ התוך עיני. בסופו של הניתוח לשטוף את המחט דרך עם פוספט הראשון שנאגרו (PBS), ולאחר מכן 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, על מנת להבטיח את משך שימוש במחט בהליכים נפרדים. לחלופין, אפשר להשתמש במחטים חד פעמיות אם שילוב מד והמזרק הנכון זמין. אופציונליות: מחטים עשויות להיות מחודדות באמצעות beveller להאריך את השימוש בם. בשלב זה במידת צורך, להסיר את המגנט, ולהשתמש בו כדי לצייר חרוזים לתחומי כיסוי חלקי. השאר את המגנט במקום סביב העין ללאחר הזרקה 10 דקות נוספת כדי להבטיח חרוזים להתיישב גם לזווית iridocorneal. הרדמה הפוכה באמצעות 0.25 מ"ג / קילוגרם hydrochloride atipemezole. לנהל כלורמפניקול, או משחה אנטיביוטית אחרת, למשל gentamycin או טרמיצין topically כדי למנוע זיהום, ושל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. השאר בעלי חיים להתאושש על מחצלת חום עד שהן חוזרים לתנועה, ולאחר מכן להעביר לתיבה חמה ואספקה ​​עם תזונה נוספת, כגון תוסף מזון או דיאטה רגילה טבולה עד להחלמה מלאה. שיכוך כאבים מערכתיים או מקומיים יש לתת לבעלי חיים בו מוצגות סימנים של כאב 24 שעות לאחר ניתוח. אם thesסימפטומים דואר להתמיד למרות טיפול, בעלי החיים צריכים להיות שלוקטו בצורה אנושית. השתמש בעין הנגדית כשליטת unoperated. קח מדידות לחצו תוך עיניות כל 2-3 ימים לאחר מתן חרוז, וכל 2-3 ימים לאחר מכן באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. הקריטריונים להכללת עיניים בלימודים יכולים להיות: אם 1) IOP מוגבה מעל הלחץ הנגדי על ידי שליטת 5 מ"מ כספית, ו -2) לא יעלו על 60 מ"מ כספית. עיניים שבו חוזר לנקודת התחלת הלחץ (בדרך כלל על ידי לאחר הזרקת שבוע 1) לא צריך להיות כלולה בלימודים, אך זה אפשרי חרוזים מחדש להזריק בעיניים שאינם מצליחים לפתח גבוה IOP אם תרצה בכך. להרדים בעלי חיים על ידי CO 2 מחנק בסוף הניסוי. לנתח את העיניים ועצבי ראייה, ולתקן בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה לניתוח היסטולוגית נוסף. 2. הערכת נזק לרשתית Neuron שימוש TUNEL Staining כדי לכמת תאים אפופטוטיים בהר שלם retinasuse assay dUTP ניק תיוג בתיווך transferase deoxynucleotidyl המסוף (TUNEL), על פי הוראות היצרן. לנתח את הרשתית מכוס עין, לשטוף 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% Triton X-100 בפוספט שנאגרו מלוח (T-PBS). Permeabilize הרקמה ב 3% T-PBS עבור שעה 2. טרום לאזן רשתית באיזון הצפת למשך 10 דקות, לפני הדגירה בפתרון תגובת TUNEL עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. שטוף את הרקמה למשך 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% T-PBS, לשטוף בשיעור של 0.3% T-PBS המכיל 5 מיקרומטר DAPI, ושטוח הר בתקשורת הרכבה. כדי לכמת גרעינים חיוביים TUNEL להשתמש מיקרוסקופ confocal לקחת 10 מיקרומטר Z- ערימות דרך שכבת תא גנגליון בהגדלה 20X. קח 3 תמונות בכל אחד 4 עלי הכותרת, באתרים קרובים לעצב הראייה, באמצע הפריפריה-, ובפריפריה הרחוקה של הרשתית, נותן סך של 12 תמונות לכל mount, דגימה כ -7,000 תאים. קריטריונים מורפולוגיים מופלים שאינו עצבי (אנדותל וגליה) תאים מהתאים עצביים. אזורי בחירה להדמיה באמצעות רק ערוץ DAPI, וחוקרי מסכה לקבוצות טיפול. 3. הערכת נזק לעצב הראייה באמצעות toluidine הכחול מכתים תקן את עצבי ראייה הלילה בפתרון של Karnovsky ב 4 מעלות צלזיוס. פנק את הדגימות עבור שעה 2 ב 1% (w / v) tetroxide אוסמיום ולאחר מכן ליבש באתנול 100%. דגירה עצבי ראייה בפרופילן אוקסיד למשך 30 דקות, ואת המקום בתערובת 50:50 של פרופילן אוקסיד: לילה araldite. לשנות את הפתרון הזה ל -100 araldite%, ואחריו דגירה הלילה בשעה 60 ° C. קטעי Cut semithin (0.75 מ"מ עובי) וכתם עם toluidine 1% כחולים / בורקס (TB) ב 50% אתנול לפני הבדיקה על ידי מיקרוסקופ אור. 4. ניתוח סטטיסטי לבצע ana הסטטיסטיlyses באמצעות חבילת תוכנת סטטיסטיקה מתאימה. דו כיוונית ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של ניומן-קאול ניתן להשתמש כדי לחשב מובהקות סטטיסטיות לIOP משתנה על פני זמן. ערך p של פחות מ 0.05 עשוי להיחשב משמעותי.