التجريبية الزرق المستحث بواسطة حقن العيني من المجهرية المغناطيسي
Summary
We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.
Abstract
Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.
Introduction
الزرق الأساسي هو مرض العين المدمر تؤثر يقدر ب 60500000 الناس في جميع أنحاء العالم 1، والذي يمكن أن يؤدي إلى تغيير الحياة وفقدان البصر والعمى 2. البحث في آليات المرض، وتطوير علاجات جديدة للزرق، تعتمد على نماذج جيدة من هذا المرض الذي ألخص بعض من السمات المميزة لعلم الأمراض.
نقدم هنا نموذجا الزرق الفئران على أساس طريقة Samsel وآخرون. 3 ويتمثل الهدف العام من هذه التقنية هو زيادة ضغط العين (IOP) في العين عن طريق حقن المجهرية المغناطيسية في الغرفة الأمامية، وباستخدام رنين مغناطيسي، مباشرة لهم في زاوية القزحية القرنوية. هذا يعوق تدفق مائي، مما يزيد IOP، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية وفقدان الخلية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول في محاولة لتوفير أبسط، نموذج محرض من الزرق.
قد يكون هذا البروتوكول بعض المزاياعلى التقنيات الموجودة. هي المتاحة، والتي لا تتطلب إجراءات لبدء نماذج الماوس الوراثية مثل DBA / 2J. ولكن هذه قد يكون لها بداية لا يمكن التنبؤ به من تطور المرض (4). في المقابل، نماذج محرض، وهي في معظمها تعتمد على رفع جراحيا IOP في القوارض، لديها ميزة أن الشروع يمكن التحكم من قبل المستخدم. بعض من هذه الأساليب قد يكون لها عيوب خاصة بهم مع ذلك، بما في ذلك كونه تحديا تقنيا 5، ويمكن أن تتطلب إجراءات متعددة للحفاظ على IOP ارتفاع 6.
في المقابل، فإن طريقة محرض بالتفصيل في هذه المخطوطة هي تقنية بسيطة وفعالة، وقابلة للتكرار أن تنتج، ويزيد من قوة مستقرة في الضغط، مع الحد الأدنى من الحاجة إلى إعادة حقن. بالإضافة إلى ذلك، أنها لا تنطوي على معدات باهظة الثمن، ويتطلب فقط المهارات الجراحية الأساسية لأداء. قد يكون هذا البروتوكول المناسب للقراء الذين يتطلعون لاقامة تطالب أقل من الناحية الفنية محرضنموذج الزرق في المختبرات الخاصة بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا لشرح طريقة لإحداث IOP مرتفعة في الفئران، عن طريق حقن المجهرية المغناطيسية في الغرفة الأمامية للعين. وهذه طريقة بسيطة للقيام بها، ويتطلب خبرة جراحية قليلا، أو ساعة من الممارسة والصقل. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء هو فعال؛ نادرا ما يتطلب أكثر من حقنة واحدة من حبات للحث على، وارتفاع قوي قوي في الضغط (ما يقرب من 10٪ معدل إعادة حقن). قد توفر هذه ميزة على أساليب محرض القائمة، مثل الوريد episceral تحديا تقنيا التصلب 11 نموذج، أو الليزر الضوئي بروتوكول 6، والتي يمكن أن تتطلب إجراءات متعددة لرفع الحفاظ على IOP.
من أجل أن طريقة لتكون ناجحة ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الحاسمة الصغيرة التي تحتاج إلى اتخاذها. أولا أنه من المفيد استخدام مغناطيس على شكل حلقية لرسم حبات في زاوية القزحية القرنوية. هذه الخطوة هو تعديل البروتوكول الأصلي، وهره تم حقن حبات في الغرفة الأمامية، ثم انتقل مرفوعة حول العين 3. باستخدام مغناطيس حلقي يعني أن المجهرية يجب أن تستقر بالتساوي في جميع أنحاء زاوية، والتي تتطلب الحد الأدنى من إعادة توزيع اليدوي. ثانيا، ينبغي أن يكون معدل الحقن بسرعة – بطيئة جدا وسوف الخرز تتراكم في الغالب على جانب واحد من زاوية، مما يؤدي إلى تغطية غير مكتملة، وربما عدم ارتفاع الضغط. وبصفة عامة على الرغم من هذه الطريقة واضحة بما فيه الكفاية أن المستخدم يمكن بسهولة إجراء تعديلات على البروتوكول، مثل متفاوتة الحجم أو حجم الجسيمات المكروية، ربما في محاولة لتغيير درجة ارتفاع IOP.
ومع ذلك، واحد العيب المحتمل للطريقة هو أن على المرء أن سيطرة تذكر على مدى ارتفاع ضغط الدم، والتي ارتفعت في حوالي 5-10٪ من الحالات لاحظنا فوق 60 مم زئبق. ارتفاع المفرطة في IOP يمكن أن تكون مدمرة جدا لأنسجة الشبكية، ويمكن أن تجعل دراسة آليات والبيولوجيةبليد الحركة من موت الخلايا تحديا. ومع ذلك، ينتج الأسلوب علم الأمراض العصبية ثابت، سواء في شبكية العين والعصب البصري، والتي يمكن التلاعب عقاقيري 12. وهذا قد جعل نموذج جاذبية لتطوير علاجات جديدة لعلاج الجلوكوما. بالإضافة إلى ذلك، لأن الخرز وتوجه إلى زاوية القزحية القرنوية، وهذا يترك محور البصري الحرة للتصوير المباشر لشبكية العين أو البصرية القرص. ونحن نتوقع أن هذا النموذج سيتم تكييفها واستخدامها في التطبيقات المستقبلية في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الماوس.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 250-300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (Ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33-guage bevelled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield Mounting Media | Vector Labs | H-1000 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review. JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Libby, R. T., et al. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).
- Morrison, J. C. Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat. J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).
- Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat. Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).
- Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).
- Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).
- Isenberg, S. J. The ocular application of povidone-iodine. Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Foxton, R. H., et al. VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma. Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).
