Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi. 1. İskelet Kası Biyopsi Daha önce açıklandığı gibi, 9 bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin. NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi. NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom 10 o uyarlanmıştır. Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin. Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al. Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal "pop" veya direnç izleyin. , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance. Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın. NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer. 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın. Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın. , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek. NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg. 2. Mitokondriyal İzolasyon <ol> Taze deneyde, ya alikotunun gününde Chappel-Perry (CP) ve Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) tamponları (Tablo 1) hazırlamak ve -20 ° C'de saklayın. -20 ° C de, 2.5 mM konsantrasyonda ve tablet ve mağazada dimetil sülfoksit bileşikleri hazırlayınız. Hazırlama gününe 2 ay içinde -20 ° C sıcaklıkta depolanmış ara bellek ve bileşik alikotları kullanın. Keskin bir makas ve cımbız kullanarak numune görülebilir bağ dokusu çıkarın; kullanabilme Bu aşama için bir mikroskop gerekirse. İyice kan ayrılması için buz-soğuğu DPBS tamponu ile numuneler- 3-4 kez yıkayın. Biyopsisinden fazla 45 dakika fazla dikkat ederek, en kısa sürede, buz gibi soğuk DPBS ile süreci örnekleri tutun. Dikkatle kas örnekten herhangi tendonları veya yağ doku kaldırmak için önlem alın. Hemen makas steril bir çifti kullanılarak ince parçalar halinde doğrayın kas dokusu ve 1 ml TÜFE içeren pr 500 ul askıya0.2 mg / g doku konsantrasyonunda oteinase (Nagarse). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyon ile takip ve sonra buz transfer. Otomatik bir homojenleştirici kullanılarak Nagarse ile muamele kıyılmış dokular homojenize edilir. Bu süreç boyunca buz üzerinde örnek tutun. 10.000 rpm'lik bir hız ayarında otomatik homojenleştirici kullanılarak, 2 saniyelik bir darbe için, her doku numunesinde dört kez, her zaman homojen hale getirilir. Dokular arasında damıtılmış su, ardından% 70 etanol ile sonda yıkanır. CP I (1 ml 500 ul) ve CP II 2x hacmi (2 ml 1 mi) bir eşit hacmi ile homojenleştirilir doku yıkayın ve 600 x g'de, 4 ° C sıcaklıkta bulunan bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içeriği toplamak 10 dk. Bir ıslatılmış bez ile peynir süpernatant geçmek süzüntü toplamak ve böylece olmayan mitokondriyal fraksiyonların çoğunluğunu kaldırarak, pelet atın. 3. Yıkama Mitokondri 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin. NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir. CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin. NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir. 4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik <pSınıf = "jove_content"> Not: respirometrik ölçümlerde, veya Western blot deneyleri için 24 çukurlu mikro-üzerine yüklenmesi için kullanılacak mitokondri miktarını hesaplamak için bu konsantrasyon kullanın. Protein konsantrasyonu hesaplanmasında dikkate seyreltme faktörü (10) atın. Rogers, GW ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 5. XF tahlilleri yapın. 12 NOT: pmole O 2 / dk O 2 tüketimi oranını (OCR) gözünüzde canlandırın, ya da veri çıkışı O 2 ve pH mutlak seviyeleri. Bileşikleri hazırlamak için 1x MAS kullanarak enjekte edilecek. Aşağıdaki gibi, bir son konsantrasyon elde etmek üzere bağlantı noktaları MS bileşiklerin 10x konsantrasyon ekleyin: Noktası A ADP [Adenozin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; B portu, oligomycin (2 uM, 55 ul); Port C, FCCP [karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon, 6 uM, 60 ul]; ve liman D, 2 mcM antimycin-A (65 ul). Hazırlamakkuyu sayısı için bileşiklerin yeterli bir miktar. Titrasyonuyla mitokondri optimum miktarda belirleyin. Örneğin, yük 1.0 ug, 2.5 ug, ve alt tabaka ihtiva eden buzla soğutulmuş 1x MAS bir 50 ul hacim içinde oyuk başına mitokondri 5.0 ug. İlk soğuk 1x MAS + substrat 10x mitokondri sulandırmak, kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için. Sonraki, (arka plan düzeltme kuyuları hariç) her bir kuyunun bu süspansiyon 50 ul teslim. 2000 x g'de, 4 ° C'de 20 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Her bir oyuğa (bakınız aşağıda başlangıç ​​koşullarına) Santrifüj işleminden sonra, yavaşça 1 x MAS + süksinat (10 mM) ve rotenone (2 uM) 450 ul ilave edin. XF analizörü plaka transfer iyi önce homojen yapışmasını sağlamak için mikroskop altında mitokondri görüntüle. Not: solunum ya da VB kompleksi I ya da kompleks II kaynaklı olup olmadığının bağlıdır kullanılan başlangıç ​​koşullarını oluşturmuştur. Karmaşık II-odaklı solunum için, SU kullanınccinate (10 mM) ve başlangıç ​​koşulları olarak rotenon (2 uM). Rotenone blokları kompleks I ve II süksinat kompleksi (süksinat dehidrogenaz) için yakıt sağlar. Kompleks I tarafından tahrik edilen solunum çalışma yapmak için, ilk koşullar olarak 10 mM'lik bir son konsantrasyonda 5 mM veya glutamat ve malat, her bir son konsantrasyonda piruvat ve malat, her birini kullanabilirsiniz. İkincisi trikarboksilik asit döngüsü ve yüzey ulaşım arasındaki disfonksiyon ayırt yardımcı olabilir. Hem kompleks I ve II kompleksi tarafından tahrik solunum çalışma başlangıç ​​koşulları olarak rotenone veya malat olmadan piruvat ve süksinat dahil etmek. Β-oksidasyonu için bir alt-tabaka olarak palmitoil karnitin kullanın. Sırayla önce 12 açıklandığı gibi programlayarak solunumu kullanarak gerçek zamanlı olarak mitokondriyal solunum ölçmek. Tablo 2'de verilmiştir respirometredeki ayarlarını kullanın. NOT: aşağıdaki gibi çeşitli mitokondriyal solunum devletlerin kısa bir açıklama vardır: <li> Devlet 2 = substrat mevcut ile birleştiğinde devlet; Devlet ADP doyurarak varlığında solunum fosforile 3 =; Oligomycin tarafından uyarılan Devlet 4 o = olmayan fosforile solunum; Devlet 3u = uncoupler FCCP tarafından uyarılan maksimal uncoupled solunum; Antimycin-A karmaşık III inhibisyonu sonrası rezidüel olmayan mitokondriyal solunum = solunum. Aynı zamanda mitokondriyal konsantrasyon ile birlikte OCR ölçüm uzunluğu ölçümü dönemlerinde oksijen tüketen verileri etkileyebilecek, işaret edilmelidir. 6. Western Blot NOT: Son örnek mitokondri zenginleştirme sağlamak için Western blot ile mitokondriyal işaretleyici COX IV ve tüm doku GAPDH belirleyin % 12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelleri izole edilmiş mitokondri ve bütün doku özü ayırın. Poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın. COX IV antikoru (1: 20,000) ile inkübe yaban turpu peroksidaz (HRP), ve ardından ikincil antikorlar ile konjüge edilmiş. GAPDH tespiti için, bir GAPDH monoklonal antikor (: 2,000 1) ile leke ve prob şerit. NOT: ER kontaminasyon farklılıklar endişe ise, böyle bir analiz ERp72, calnexin, ya kalretikulin olarak ER işaretçileri bulunur.