광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.
절연 미토콘드리아 호흡계 프로파일은 일반적으로 전자 수송 체인 기능을 조사하기 위해 사용된다. 우리는 세포 외 플럭스 (XF) 분석기를 사용하여, 인간의 측광 근 lateralis의 샘플들을 획득하는 골격근 조직 최소량에서 미토콘드리아를 분리하는 방법은, 기초 플레이트 및 호흡계 프로파일을 설명한다. 1.0, 2.5 및 미토콘드리아의 5.0 μg의를 사용하여 얻은 호흡계 프로파일의 비교는 1.0 μg의는 호흡을 측정하기 위해 충분하다는 것을 나타냅니다 및 5.0 μg의 표준 오차의 비교를 기반으로 가장 일관된 결과를 제공. 미토콘드리아 마커 COX IV 및 비 미토콘드리아 조직 마커 GAPDH에 대한 격리 된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석이 프로토콜을 사용하여 제한된 비 미토콘드리아 오염이 있음을 나타냅니다. 근육 조직의 적은 20 mg의 미토콘드리아 respirometry을 연구 할 수있는 기능은 사용자가 임상에서 여러 연구 엔드 포인트에 대한 개별 조직 검사를 활용할 수 있습니다연구 프로젝트.
미토콘드리아는 세포의 주 에너지 생산 현장이며 노화에 중요한 역할뿐만 아니라 심혈관 질환, 알츠하이머 질환, 당뇨병, 암, 비만 등의 각종 연령 관련 질환이있다. 격리 된 미토콘드리아의 호흡계 프로파일 링은 전자 수송 체인 (ETC) 함수를 직접 분석을 제공하고, 미토콘드리아 생물학에 대한 우리의 이해와 건강과 질병에서의 역할에 크게 기여하고있다. 격리 미토콘드리아이 원고에 기재된 방법론은 피험자로부터 얻어 골격근 조직 생검으로부터 분리 미토콘드리아 호흡계 분석을 허용하도록 최적화되었다 등 기판 운반, ATP 합성 효소 활성, 양자 누출, 같은 생체 에너지의 다양한 양상을 연구하기 위해 사용된다. 이 논문에 기술 된 조직 검사 프로토콜은 지난 12 년 동안 우리의 직원에 의해 이용되고있다. 우리 그룹은 다양한 연령대의 성인에 700 절차를 수행하고있다90년 이전까지, 어떤 불리한 안전 문제없이 다양한 만성 질환 조건. 이 프로토콜의 중요한 측면은 특별히 이에 임상 연구 과정에서의 사용을 촉진, 조직의 최소량을 이용하도록 설계되어 있다는 것이다.
다양한 프로토콜은 미토콘드리아를 분리하기 위해 개발되었다. 페르난데스-Vizarra 등. 1,2- 다양한 랫트 조직뿐만 아니라 배양 된 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 방법을 설명했다. 가르시아 – Cazarin 등. 3 쥐와 마우스에서 골격 근육에서 미토콘드리아를 분리하는 방법을보고있다. 쥐의 뇌에서 미토콘드리아를 분리하는 방법도 이글 레시아 – 곤잘레스 등. 4 총에 의해보고 된, 등. 5 barocycler 및 / 또는 PCT 분쇄기를 사용하여 미토콘드리아를 분리하는 방법을보고했다. 최근, 프랑코 등. 6 항을 이용하여 고농축 미토콘드리아를 단리하는 방법을보고-TOM22 자석 구슬.
이러한 프로토콜은 우수한 결과를 산출하는 동안, 조직 크기 요구는이 원고에 기재된 방법에 비해 높다. 예를 들어, 총 등. 5 비복근 근육 1.5-1.8 g 및 신장 조직의 약 2g을 사용했다. 마찬가지로, 프랑코 등. 6은 500 mg의 마우스 간 조직을 사용 하였다. 우리의 경험에서, 전형적인 수율은 골격 근육 (광근의 lateralis)의 경피적 바늘 생검에서 예상되는 100 ~ 200 mg의 범위. 여기에 설명 된 프로토콜을 이용하여 근육 조직에 20-50 mg의 미토콘드리아 기능을 평가하는 능력은 다른 분자 생물학 실험하는데있어서의 장래의 사용을 위해 저장 당 생검 샘플에 여러 평가를 수행 할 수 있도록 허용. 이 임상 연구 및 샘플의 성실한 사용을 필요로하는 다른 연구에서 중요한 기능입니다. 그것은 이전에 냉동 미토콘드리아가 oute에 커플 호흡으로 인해 공부에 대한 좋은 아니라는 것을 주목해야한다미토콘드리아 막 손상 및 시토크롬 C 활동의 손실을 r에. 우리의 방법은 적응 챠펠 및 페리 (7) 발행 방법에서 수정되었습니다.
이 원고에 설명 된 방법을 사용하여, 우리는 최근 인간의 광근에서 분리 된 미토콘드리아의 호흡계의 프로필을 직접 보행 속도 (8)로 측정 된 신체 능력과 상관 관계가 lateralis 것으로보고있다.
미토콘드리아는 종종 절연 기판 운반 및 TCA 사이클 기능을 구비 ETC 함수의 역할뿐만 아니라 다른 미토콘드리아 활동을 조사 연구에 이용된다. 고립 된 세포 기관을 사용 호흡계 분석은 산화 적 인산화의 기본 프로세스와 등 고유 특성을 직접 시험을 허용 전체 세포 또는 투과 가능 근육 섬유에 비해 고립 된 미토콘드리아의 호흡계 프로파일 링은 상대적으로 쉽게 데이터 해석의 장점과 미토콘드리아 질량 / 생물 발생에 비 미토콘드리아 프로세스 또는 변경에서 "간섭"의 부재가있다. 데이터의 정규화함으로써 샘플 간의 미토콘드리아 간단한 상호 비교를 허용 미토콘드리아 단백질 함량에 기초한다. 절연 미토콘드리아 호흡계 프로파일 링 연구의 목적은 기저 메커니즘 및 ETC 성분으로서 특정 목표물을 식별 결정하는 바람직한 접근법이다S / 착체 또는 미토콘드리아 반송기구.
작은 조직 샘플에서 근육 조직 검사 및 기능 미토콘드리아의 분리를위한 프로토콜입니다 설명한다. 손 다운스 균질화 조작 대 인해이 방법은 자동화 된 균질의 사용자들 사이에 이용 재현 가능한 결과를 산출한다. 미토콘드리아의 분리 근조직의 적은 20 mg을 행할 수있다. 이 샘플 크기로부터 얻어 질 수 절연 미토콘드리아의 양은 상기 분자에 대한 다른 실험 분석 및 저장을 위해 잉여 미토콘드리아 남기고 해마 플레이트 기반 respirometry을 실행하기에 충분하다. 이것은이 방법은 미토콘드리아의 더 작은 양 (μg의 웰 당 1-2)을 사용할 수있다 XF (96)로 변환 될 수 있다는 점에주의 할 수있다.
분리 미토콘드리아에 대한 몇 가지 프로토콜은 초기 조직 중단에 대한 다운스 균질에 의존하고있다. 이 방법의 단점은 실습 초기 조직의 특성상균질화. 균질에서 유봉의 힘과 속도는 사업자 6 사이에 상당히 다를 수 있습니다. 이 실험 대 실험 변동뿐만 아니라 실험실 사이 변동 초래 실험간에 데이터를 비교하는 어려움에 이르게 할 수있다. 참가자의 데이터가 일반적으로 치료 전과 후, 그리고 잠재적으로 여러 사이트에서 별도의 시점에서 수집 할 때 인간의 개입 연구에서 특별히 관심을 가져야하는 부분입니다. 우리는 제한된 개인 대 개인의 변화와 재현성 결과를 얻을 수보다 일관된 접근 방식에 대한 자동화 된 호모 게 나이저를 사용합니다. 제제의 속도도 동시에 여러 샘플을 처리하기에 적합한 이러한 접근한다. 통상적으로, 최대 세 실험은 하루에 수행 될 수있다.
여기에 기재된 기술의 제한점을 격리 소기관의 사용과 플레이트 – 기반 포맷의 사용으로부터 발생한다. 예를 들어는, 피카 등. 악마가격리 된 미토콘드리아가 투과 가능 근섬유에 손상 미토콘드리아와는 근본적으로 다른 기능적 특성을 가지고 있음을 strated. 그들은 미토콘드리아 분리 기술은 큰 반응성 산소 종 생산을 13 수반 투과 가능 근섬유에 비해 상당히 증가 RCR로서 바이오 에너지 변경된 기능 발생할 것을 제안했다. 투과 가능 근육 섬유에 비해 미토콘드리아 단리 긴 준비 시간이 필요 않는다. 또한, 휴대 내용의 손실은 생리 학적 관련성, 전체 세포와도 투과 가능 섬유에 유지 뭔가를 감소. 설명 된 기술 허가와 함께 접시 기반 respirometry의 사용은 샘플 당 실행을 복제합니다. 그러나 미토콘드리아 각 웰의 바닥을 준수해야합니다. 이 구성은 통상 상이한 환경 및 기능적 특성에 영향을 미칠 수있다. 또한, 유의할 점은이 미토콘드리아 단리 프로토콜을 사용하여, 거기는전자는 여전히 미토콘드리아 준비 소포체 (ER)에서 오염 될 수있다. ER 오염의 차이는 미토콘드리아의 수율과 영향력 결과의 결정에 영향을 미칠 수 있습니다.
결론적으로,이 연구는이 절차를 사용하여 조직으로부터 격리 미토콘드리아 기능적 활성 연구 및 / 골격근 샘플 최소량에서 고품질 절연 미토콘드리아를 필요로하는 애플리케이션을 위해 사용될 수 있음을 확인하는 데이터를 제공한다. 이 방법의 장점이 있다는 것이다 : I)는 골격근의 최소량에서 미토콘드리아를 분리 할 수 있고, ⅱ) 과정은, ⅲ) 플레이트 기반 기술로는 동시에 여러 샘플을 실행할 수있어, 신속 및 ⅳ) 샘플 저장 및 다른 분자 생물학적 연구를위한 바이오 에너지 분석 후 충분한 잉여 조직과 격리 된 미토콘드리아가있다.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Equipment | ||
Name of the Equipment | Company | |
Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
60cc syringe | Fisher Scientific | |
96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
Consumables | ||
Name | Company | Catalog Number |
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
100867-100 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |