経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

注：医学のウェイクフォレストの学校の治験審査委員会によって承認された記載されたプロトコル。インフォームドコンセントを書面で得られた。すべての参加者は23から35までの範囲のBMIで、男女の健全な高齢者（65-79歳）であった。 1.骨格筋生検前述したように、 図9は、O / N絶食後の早朝にすべての生検を行う。生検の前に一週間出血、血小板、または挫傷に影響を与える可能性がアスピリン、処方店頭非ステロイド性抗炎症薬、または他の化合物を服用を控えるように被験者に依頼。また、生検の前に少なくとも36時間、どんな激しい運動を控えるよう、参加者に依頼する。 注：筋肉が広1％リドカインによる局所麻酔下で経皮針を経皮的針生検技術を使用してヘイケボタルから得られる。医学的合併症ないか、またはOTHERはプロシージャから有害事象は、当社の臨床研究ユニットで発生したと報告した。 注：記載の生検手順は、バーグストロム10のそれに適合されている。 簡単に説明すると、ローカルで筋肉に侵入しないように注意しながら1％のリドカインを管理する。十分な麻痺を可能にするために10分間の待機期間でこれに従ってください。 筋膜下とmyotendonous地域を避け筋肉（挿入と原点との筋肉の中間領域）の腹から生検を取る。 経皮的針（ウィンドウと内側の切断シリンダの切断面を吸引補助再利用可能なデバイス）を使用し、ガイドとしての筋膜の筋膜「ポップ」または抵抗に従ってください。 麻酔針で深さを推定し、その後再び狭いメスの刃でそれを感じ、筋膜を通して4〜5ミリメ​​ートルの切開を作る。それは筋肉の中に挿入されるまで、切開部を通して針を進める。 集めるウィンドウを持つ複数のサンプルは、異なる方向に回転。前進と異なる方向に経皮的針に2〜4回の筋肉サンプルを抜き出しながら60ccのシリンジを使用して連続的な吸引を適用する。吸引を中止し、針を取り除く。 注：各パス（挿入と針の除去）が分未満を取る必要があります。 アシスタントは止血を確立するために5分間のサイトを穿刺するしっかりと圧力をかけています。吸引チューブから針を外し、慎重に窓やバレルから筋肉のサンプルを削除する。 より多くの筋肉は、上記の手順を繰り返すことによって必要とされる場合は、2番目のパスを作成します。 、鉗子を用いて、筋肉のサンプルから目に見える血の塊を削除するサンプルの重量を量ると、すぐに氷のように冷たいDPBSを含むチューブ内に配置。 注：この方法を使用して、平均収量は150±20 mgである。 2.ミトコンドリアの単離 <OL> たての実験、またはアリコートの日にチャペル·ペリー（CP）とミトコンドリアアッセイソリューション（MAS）のバッファ（ 表1）を調製し、-20℃で保管してください。 -20℃で2.5 mMの濃度と分量や店舗でジメチルスルホキシド中の化合物を調製した。準備の日から2ヶ月以内に-20℃で保存バッファおよび化合物アリコートを使用してください。 鋭いハサミとピンセットを使用してサンプルから見える結合組織を削除する。必要であれば、このステップのために解剖顕微鏡を使用しています。徹底的に血液を除去するために、氷冷DPBS緩衝液で検体を3〜4回​​洗う。生検から45以上の分を超えないように注意しながら、できるだけ早く氷のように冷たいDPBSとプロセス上のサンプルを保管してください。慎重に筋肉のサンプルから任意の腱または脂肪組織を除去するための予防策を取る。 すぐにはさみの無菌のペアを使用して細かい破片に筋肉組織を切るとPRを含む1ミリリットルのCPIに500μlの一時停止0.2ミリグラム/ g組織の濃度でoteinase（Nagarse）。 RTで5分間のインキュベーションでこれに従ってくださいしてから氷に移す。 自動化されたホモジナイザーを用いてNagarseで処理されたみじん切り組織を均質化する。このプロセスを通して氷上にサンプルを保管してください。 10000回転の速度設定で自動ホモジナイザーを用いて、2秒のパルスに対して各組織試料を4回、毎回ホモジナイズする。組織間の蒸留水に続いて70％エタノールでプローブを洗ってください。 CP I（1 mlの500μlの）及びCP IIの2倍の体積（2 mlの1ml）を、等量のホモジナイズした組織を洗浄し、600×gで、4℃で遠心分離用チューブに遠心機でコンテンツを収集10分。濡れたチーズクロスを通して上清を渡し、ろ液を収集し、ペレットを廃棄し、したがって非ミトコンドリア画分の大部分を取り除く。 3.洗濯ミトコンドリア 10で上記のステップからの上清を遠心、000×gで、10分間、4°C。を10,000×g、10分間、4℃でCP IIバッファし、さらに遠心分離機の4ミリリットル中にペレットを一時停止します。 注：まれに、血液の薄いペレットはミトコンドリアのペレットの下に形成されている。その場合には、CPII緩衝液で穏やかな吸引によってミトコンドリアのペレットを削除します。このステップは、十分に、ステップ2で血液を洗い流すことによって回避することができる。 CP Iのバッファの2ミリリットルで得られたペレットを一時停止します。この段階で、タンパク質の推定のために、この懸濁液から少量を使用しています。私は上記のようにバッファリングし、遠心機CPの残りのサンプルを懸濁します。ミトコンドリアアッセイソリューション（MAS）の最小量（200μL）で最終ペレットを一時停止します。 メモ：CP Iバッファは、BSAを持っていないため、サンプルは、後に中断されているMASがそれにBSAを持っているのに対し、タンパク質は、この段階でアッセイされる。 4.見積もりBCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定することによるミトコンドリアコンテンツ<pクラス= "jove_content">注：呼吸計測測定のために、またはウェスタンブロット実験のために24ウェルマイクロプレート上にロードするために使用されるミトコンドリアの量を計算するためにこの濃度を使用してください。タンパク質濃度の計算のために考慮に希釈係数（10）を取る。 ロジャース、GW らによって記載されているように5 XFアッセイを行う。12 NOTE：ピコモルO 2 /分でO 2消費率（OCR）を可視化するか、データ出力中のO 2およびpHの絶対レベル。 化合物を調製するための1x MASを使用する注入される。次のように最終濃度を得たポートのADへの化合物の10倍の濃度を追加します。ポートA、ADP [アデノシン5 '二リン酸、2mMの、50μL];ポートB、オリゴマイシン（2μM、55μL）;ポートC、FCCP [カルボニルシアン化4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、6μM、60μL];とポートD、2μMのアンチマイシンA（65μL）。準備する井戸の必要な数のための化合物の十分なボリューム。 滴定によってミトコンドリアの最適量を決定します。たとえば、負荷1.0μgの、2.5μgの、そしてウェルあたりのミトコンドリアの5.0μgの基質を含む氷冷1X MASの50μl容量で。ウェル間のばらつきを最小限に抑えるために、最初に冷たい1X MAS +基板に10倍のミトコンドリアを希釈。次に、（バックグラウンド補正ウェルを除く）を各ウェルにこの懸濁液50μlをお届け。 遠心機で4℃で2000×gで、20分でプレート。各ウェルに、遠心分離した後、軽く1XのMAS +コハク酸（10 mM）をし、ロテノン（2μM）（下記参照初期条件）の450μlを添加する。 XFアナライザにプレートを転送をウェルに均質な遵守を確保するために顕微鏡下でミトコンドリアを表示します。 注：使用される初期条件は、呼吸がETC複合体Iまたは複合体IIのどちらかで駆動されているかどうかに依存します。複合体II主導の呼吸のため、SUを使用ccinate（10 mM）を、初期条件としてロテノン（2μM）。ロテノンブロック複合体Iおよびコハク酸は、複合体II（コハク酸デヒドロゲナーゼ）のための燃料を提供しています。複合体Iによって駆動呼吸を研究するために、初期条件として10mMの最終濃度で5mm以上のグルタミン酸とリンゴ酸各の最終濃度でピルビン酸とリンゴ酸、それぞれのいずれかを使用する。後者は、トリカルボン酸サイクルと基板搬送の間で機能不全とを区別するのに役立つことができる。複合体Iおよび複合体IIの両方で駆動呼吸を研究するために、初期条件としてロテノンまたはリンゴ酸なしでピルビン酸およびコハク酸が含まれています。 β酸化の基質としてミトイルカルニチンを使用してください。 順次以前に12を説明したように、それをプログラムすることによって呼吸計を使用してリアルタイムでミトコンドリア呼吸を測定する。 表2に設けられた呼吸の設定を使用してください。 注：次のようにさまざまなミトコンドリア呼吸状態の簡単な説明は以下のとおりです。 <li>状態2 =基板存在との結合状態。 ADPを飽和の存在下で呼吸をリン酸化状態3 =;オリゴマイシンにより誘導された状態4 O =非リン酸化呼吸。脱共役剤FCCPによって刺激状態3U =最大の脱共役呼吸。アンチマイシン-Aによる複合体III阻害後の残留非ミトコンドリア呼吸=呼吸。また、ミトコンドリアの濃度と組み合わせたOCR測定の長さは、測定期間中に酸素を枯渇させることにより、データに影響を与える可能性があることが指摘されるべきである。 6.ウエスタンブロット注：最終サンプル中のミトコンドリアの濃縮を確実にするためにウェスタンブロッティングによってミトコンドリアのマーカーCOX IVおよび全組織GAPDHを決定 12％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによって単離されたミトコンドリアと全体の組織抽出物を分離する。 ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にタンパク質を移す。二次抗体 – 結合、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に続く：COX IV抗体（20,000 1）と共にインキュベートする。 GAPDHの決定のために、GAPDHモノクローナル抗体（1：2000 1）とブロットとプローブを取り除く。 注：ER汚染の違いが懸念される場合は、そのような分析においてERp72、カルネキシン、またはカルレティキュリンなどのERマーカーを含む。