Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor gelokaliseerde Histopathologisch Analyse: Part 2 Epiretinal Implantaten met Retina Kopspijkers
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
Retinitis pigmentosa (RP) is een erfelijke aandoening die wijdverspreide verlies van fotoreceptoren, die de cellen in de buitenste laag van het netvlies verantwoordelijk voor het transduceren licht worden veroorzaakt, in de vorm van fotonen in neurale activiteit. Belangrijk patiënten met RP hebben typisch residuele neuronen in de andere lagen van de retina die nog functioneel. Retinale prothesen zijn in staat om het herstel van een aantal beperkte visie om deze patiënten door zich te richten deze overlevende neuronen met elektrische stimulatie om hun visuele pad 1,2 activeren. Perceptuele uitkomsten van klinische studies hebben aangetoond veelbelovende eerste resultaten en recent sommige apparaten zijn goedgekeurd voor commercieel gebruik. Momenteel zijn er drie belangrijke anatomische locaties waar klinische retinale prothesen zijn geplaatst: epiretinally 3,4, 5,6 en subretinally suprachoroidally 7,8. Verschillende apparaten maken gebruik van verschillende materialen en hun vorm is aangepastde plaats waar zij worden geïmplanteerd. Echter, ze maken visuele waarnemingen door activering van de overblijvende neuronen van de retina met elektrische pulsen.
Er is de mogelijkheid van een medische prothese beschadigen omringende weefsel door mechanische effecten van de initiële plaatsing of latere lopende krachten. Voor implanteerbare stimulatoren zoals retinale prothesen, is er het extra overweging dat de elektrische parameters moeten binnen veilige grenzen. Veiligheid van de patiënt staat voorop, dus apparaten moeten grondig worden getest in preklinische studies alvorens naar een klinische setting 9-15. In onze metgezel artikel beschreven we een methode voor de beoordeling van de gelokaliseerde histopathologie van het oog rond een implantaat geplaatst in de suprachoroïdale ruimte 16. In dit manuscript beschrijven we een techniek voor het visualiseren oogweefsel rond een elektrode-array geplakt op het netvlies epiretinally, in een preklinische (felijn) model (figuur 1).
De epiretinale locatie is het meest gebruikte positie voor het lokaliseren van een visuele prothese. Elektrodenstelsels hier ligt typisch aangebracht op het netvlies met een metalen tack dat alle lagen van het oog 17-20 doordringt. Voorafgaand aan de in de onderhavige manuscript beschreven technieken, was het moeilijk om de retinale en andere weefsels onmiddellijk rondom een tack nauwkeurig te beoordelen. Standaard oogfixatie met neutrale gebufferde formaline gevolg kunstmatig netvlies schade door differentiële beweging van de retina en sclera tegen het vaste punt van de boeg. Daarom geen werkelijke schade veroorzaakt door de tack en epiretinale scala kon niet nauwkeurig worden nageleefd. Bovendien kan snijden oogweefsel niet worden uitgevoerd met de retinale tack in situ metalen voorwerpen niet gemakkelijk kan worden gesneden met traditionele histologische inrichting; het verwijderen van de tack voordat histologische bewerking was ookongewenst aangezien hieruit bovendien artefactuele retinale schade.
Het doel van dit onderzoek was tweeledig: 1) tot netvliesloslating artefact te verminderen, zodat eventuele schade veroorzaakt door de tack en de epiretinale implantaat reeks betrouwbare wijze kan worden beoordeeld; en 2) de retinale architectuur naast de tack visualiseren zonder het te verwijderen. Om doelstelling 1 te bereiken, werd een nieuwe proef met gebruikt (zoals beschreven in het begeleidend artikel 16), die kunstmatig netvlies delaminatie vermindert. Om doelstelling 2 te bereiken, hebben we aangepast een inbedding, slijpen en polijsten techniek, oorspronkelijk ontwikkeld voor in situ observatie van een cochleair implantaat elektroden 21-23. De in dit manuscript beschreven methoden is het mogelijk de visualisatie van het netvlies omgeving en grenst aan een tack in situ, terwijl het minimaliseren artefactuele schade aan het netvlies en het daardoor mogelijk een nauwkeurige evaluatie van de mogelijke schade veroorzaakt door de tack en epiretinale array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standaard histologische technieken zijn niet moeilijk metalen implantaten in situ verwerken vanwege beperkingen in deze scherpe voorwerpen van metaal, glas of zelfs diamantbladen. In onze metgezel papier 16 hebben we aangetoond dat het gebruik van een gemodificeerde proef met hele-eye kunstmatig netvlies delaminatie kunnen verminderen. In de huidige manuscript, een gevestigde slijpen en polijsten techniek voor het visualiseren van cochleaire implantaten 21-23 in situ werd aangepast voor retinale prothesen. Een titanium tack, die een elektrode array om de retina te beveiligen, epiretinally werd ingebed in epoxy met de omringende oogweefsel. Deze hars blok werd vervolgens passend georiënteerd en geleidelijk grond / gepolijst om de weefselmorfologie direct naast het metaal tack onthullen. Beelden van het gepolijste oppervlak van het blok op verschillende diepten zijn gemaakt met een krachtige dissectie microscoop. Deze techniek is nuttig voor: visualiseren en evaluating de weefselreactie naast de epiretinale implantatie; het chirurgisch trauma geassocieerd met implantatie van het implantaat te evalueren; de biologische reactie op de vaste metaalcomponenten bepalen; en de afstand tussen het implantaat en het oppervlak van het netvlies te meten.
Deze techniek zal nuttig voortaan veiligheidsstudies voor in situ visualisatie van het gebied grenzend aan een retinale tack of een ander hard (bijvoorbeeld metalen) voorwerpen in het oog. Dit heeft directe toepassing in de beoordeling van de preklinische veiligheid van prothesen geplakt op het netvlies epiretinally. Het kan ook nuttig zijn voor het evalueren van weefselschade in retinale gebieden in contact met implantaten in de sub-retinale locatie.
Er zijn verschillende manieren om te controleren of de techniek correct is uitgevoerd. In elke fase moet het netvlies blijven zitten aan de buitenste lagen van het oog. Indien sprake is van grove artefactuele netvliesloslating, kan dit indicaten een probleem met de fixatie. Wanneer het monster is ingebed en opnieuw georiënteerd in de uiteindelijke hars blokkeren de retina nabij orthogonaal het slijpen vlak van het blok moet worden; dit zal schuin snijden minimaliseren. Het is nuttig om te controleren of het aantal incrementele slijpen stappen (bekende stapgrootte) nodig om een voorwerp doorlopen (bijvoorbeeld een retinale tack) dienovereenkomstig correleren met de afmetingen van het object.
De techniek kan worden geoptimaliseerd op verschillende manieren. Krassen op het oppervlak van de epoxy blok geassocieerd met het maalproces kan worden gereduceerd met steeds fijnere polijsten. Voor de onderhavige studie, gebruikten we 800, 1000, 1200, 2400, 4000 en silicium carbide papier. Diamant pasta kan ook worden gebruikt om het oppervlak te verbeteren. Een hogere beeldkwaliteit Een fijnere afwerking geeft, maar ten koste van extra polijsten tijd. Een andere belangrijke overweging voor het verbeteren van de uitkomst van deze techniek is de keuze en kwaliteit van de optics en verlichting gebruikt voor het maken van foto's. Andere basis histologische kleuringen – bijzonder Nissl vlekken, kan worden gebruikt in plaats van toluïdineblauw, maar kan verdere optimalisatie vereisen. Sommige vlekken de hars en het weefsel (bijvoorbeeld eosine), dus een ondiepe polish kunnen na kleuring met achtergrond verkleuring te verwijderen vlek. Gespecialiseerde vlekken, fluorescerende kleurstoffen en immunohistochemische kleuring werd niet geprobeerd, maar tenzij een specifiek resultaat gewenst is, de tijd die nodig is om deze vlekken te voeren op elk maalgraad waarschijnlijk onbetaalbaar zijn. Echter, kan het mogelijk zijn om het weefsel als geheel vlek voor de inbedding stap (stap 3.4) 24.
De belangrijkste beperking van deze techniek is dat zodra het gebied van belang is weg gemalen, kan niet worden teruggehaald, dus is het verstandig om veel (eventueel redundant) beelden op verschillende vergrotingen in elke fase van slijpen en polijsten vangen. Het isook belangrijk om kleine stappen gebruiken voor elke slijpen diepte. Een andere beperking van deze techniek is dat de optische vergroting en resolutie vergeleken met weefsel aangebracht op een glasplaatje en bekeken met een standaard (transmissie) lichtmicroscoop. Voor de toepassing van prototyping en het beoordelen van de veiligheid van een nieuw implantaat, de bruto pathologische evaluatie is van primair belang. Deze techniek biedt een efficiënte methode voor het observeren van klinisch relevante schade in verband met een retinale tack. Met de praktijk, de totale tijd die nodig is om te slijpen, polijsten te verzamelen en te fotograferen een gegeven monster (een keer embedded) is vergelijkbaar met de tijd zou nemen om deel een paraffineblok of bevroren sectie.
Er is ook het potentieel voor de huidige technieken te worden uitgebreid tot toepassingen buiten het bereik van retinale implantaten. Deze techniek is geschikt voor het beoordelen van het weefsel grenzend aan een vaste implantaat, waarbij het implantaat extractie is niet feasible of zou de interface beschadigen. Bijvoorbeeld kan deze techniek worden uitgebreid met implantaten gemaakt van metaal (bijvoorbeeld platina, nitinol, enz.) Die niet met gebruikelijke histologische technieken worden gesneden, evalueren, zoals een diepe hersenen of perifere zenuwen elektroden, canules voor geneesmiddelafgifte, vasculaire stents of orthopedische prothesen.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182 (2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe’s Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -. M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
