JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Пробоподготовки Стратегии масс-спектрометрии изображений 3D-клеточной культуре Модели

Published: December 05, 2014
doi:
10.3791/52313
, ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute,University of Notre Dame

Summary

Иммортализованные линии клеток рака можно выращивать в качестве клеточных культурах 3D, полезной моделью для биологических исследований. Этот протокол описывает масс-спектрометрии изображений клеточных культур 3D, включая улучшение подготовки пробы платформы. Цель этого протокола заключается в проинструктировать пользователей, чтобы подготовить клеточных культур 3D для массового анализа изображений спектрометрии.

Abstract

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate de vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Introduction

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11

3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14

All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

Protocol

1. 3D Cell Culture и подготовка для работы с изображениями Культура соответствующую клеточную линию, т.е. НСТ116 толстой кишки линии клеток карциномы, в двумерном, монослойной культуре. Растут НСТ 116 клеток в Т-25 колбу с 5А СМИ Маккоя + 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 5% CO 2 инкубаторе до 50-70% слияния, который обычно занимает несколько дней. Клетки высвобождают с 0,25% раствором трипсина-ЭДТА и рассчитывать часть клеток с использованием гемоцитометра и окрашивания трипановым синим для проверки плотности клеток и жизнеспособность. После подсчета, развести клетки с полной среде для достижения соответствующей плотности посева в 6000 клеток / лунку или 30000 клеток / мл. 2. Подготовить агарозный покрытием 96-луночных планшетах Добавить 0,19 г агарозы с 10 мл стандартного сред в 50 мл коническую пробирку (1,5% раствор агарозы в среде) 10. Убедитесь, включение путем осторожного перемешивания. Автоклав агарозы на водяной банев течение 20 мин. Используя многоканальную пипетку, аспирация 50 мкл агарозном + медиа смеси в 60 центральных лунки плоской дном 96-луночного планшета культуры пластины. Как скважины на периферийных краев пластины имеют немного более высокие скорости испарения, добавить 200 мкл 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), вместо агарозы в этих краях. После агарозном смесь была добавлена ​​к внутренним скважин, установить пластину в сторону остыть до ~ 37 ° C перед добавлением клеток. 3. семян и, как правило трехмерной культуры Примечание: больше или меньше клетки могут быть посеяны в зависимости от требований культуры, участвующих, но было установлено, что эти условия приводят к 3D культуры клеток структур примерно 1 мм в диаметре через 10-14 дней культивирования (данные не показаны) , Добавить 200 мкл соответствующего раствора клеток (разбавленный, содержит ~ 6000 клеток) в агарозном покрытием96-луночный планшет. Накройте пластину и установить в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° С в течение клеточного роста. Изменить клеточную среду, как минимум раз в 48 часа, или при появлении средств массовой информации, которые будут менять цвет. Изменение носитель тщательно аспирационных старый носитель из вокруг небольшого культуры клеток (3D видны невооруженным глазом на 2-й день) в нижней части агарозы. Добавить 200 мкл свежей среды мягко по культуре клеток 3D. (Необязательный шаг) В этих СМИ изменений, добавить химиотерапевтические или другие препараты для тестирования. Развести препаратом выбора в конечной концентрации с полной среды и добавить необходимые 200 мкл в каждую лунку. Монитор 3D роста клеточной культуры с помощью оптического микроскопа, пока клеточные культуры 3D не примерно 1 мм в диаметре. 4. Урожай культур клеток 3D Используйте 2 мл серологические пипетки аккуратно извлеките 3D клеточную культуру из агарозы кровати. <LI> Вымойте клеточных культур 3D с PBS, осторожно пипеткой их в приблизительно 1 мл PBS в ожидании 24-луночного планшета. Передача собранной клеточной культуры 3D с помощью серологических пипетки в центрифужные пробирки для извлечения белка или метаболита, или вставлять их в режущего среды для оказания помощи в нарезка для приложений обработки изображений. 5. Вставить клеточных культур 3D в желатиновые Приготовьте раствор ~ 175 мг / мл желатина в воды высокой степени чистоты (18 МОм предпочтительно). 22,23 Смешать желатин энергично. Обратите внимание на решение становится вязким и трудно манипулировать. Поместите желатин, содержащий коническую трубку в водяной бане при температуре ~ 60 ° С и тепло, пока раствор не станет ясно, и легко аспирации. Примечание: Теплый раствор желатина быстро затвердевает, как он остынет, так выполнить все из следующих шагов быстро перед замораживанием. После его нагревают, принимать желатин непосредственно в капот культуре клеток. Держите трубку с желатином в BEAкег с предварительно разогретой водой при температуре около 60 ° C, чтобы избежать затвердевания раствора желатина. Использование 2 мл серологические пипетки, хранение 0,6 мл в теплом растворе желатина в лунку 24 с плоским дном пластины. Этого объема достаточно, чтобы покрыть дно тонким слоем. Осторожно депонировать клеточных культур 3D сразу же на верхней части желатиновой слое с помощью другого 2 мл пипетки, чтобы избежать разрыва структуры 3D. Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, на этой стадии не размещать PBS в желатин. В этом случае, однако, удалить PBS из верхней части желатина с использованием 200 мкл пипетки. После того, как культуры клеток 3D размещены на поверхности слоя желатина, тщательно пипетки другой 0,6 мл теплой смеси желатина в течение клеточных культурах 3D, таким образом, чтобы не нарушить положение культур. После второй слой размещается, заморозить желатиновые-встроенные 3D клеточных культур при -80 ° С. 6. Slice и оттепель Mount йе Желатин встраиваемый 3D клеточных культур для масс-спектрометрического изображений Снимите 24-луночного планшета, содержащую клеточные культуры 3D из морозильника. Теплый нижней части пластины с пылу с рукой, пока пинцет или скальпель не будет скользить мягко вниз в сторону хорошо. Плавно переместите пинцет или скальпель, освобождая желатин без оттаивания центр. Возьмите каплю воды на поддержку криостата и использовать это, чтобы придерживаться желатина диск к опоре. 3D клеточные культуры, встроенные в желатин легче всего резать при -30 ° С. Очистите лезвие криостата и стекла с 70% этанола перед использованием. Использование другую часть лопатки или лопасти новой для каждого 3D культуры клеток-желатиновую диска, чтобы предотвратить притупление лезвия. Использование криостат, мягко сталкиваются излишки желатин до тех пор, клеточные культуры 3D не становятся видимыми. В этот момент медленно нарезать клеточных культур 3D с плавной передачи движения при 12-16 мкм разделов. ПРИМЕЧАНИЕ: Критические факторы к нарезки включают расстояние от стекла до лезвия, угол лезвия, температура рефрижератора, а угол диска по поддержке, так что все они должны быть проверены, чтобы гарантировать устойчивые результаты. Тщательно оттепели кусочками и смонтировать их индия оксид титана (ITO) -покрытие стеклах соответствующим образом маркированы и хранить его в эксикаторе. Используйте ломтики как можно быстрее для максимального качества. 7. Матрица приложений и Получение образца для MALDI Imaging, До MALDI изображений, подготовить ломтики с соответствующей матрице. При малых молекул анализа, никаких шагов по уходу обычно не требуется. Для неповрежденной обнаружения белка, промыть ломтики в холодной 100% ацетона, жидкость Карнуа, или 70% / 95% изопропанол для удаления небольших молекул, таких как липиды, которые могут маскировать сигнал 24 -. 26 Осторожно промыть в течение не больше, чем 30 сек в то время. Небеспокоить какие-либо ломтиками. Подготовьте матрицу, в растворе органического растворителя и воды с 0,1% TFA. Для малых молекул, таких как α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA), используют 60% ACN: 40% H 2 O: 0,1% ТФК (10 мг / мл). Для обнаружения белка, такие как синаповой кислоты (30 мг / мл), используют тот же растворитель,. Для оптимального растворимости синаповой кислоты, растворяют в ацетонитриле первый перед добавлением TFA: H 2 O раствор. Другие матрицы могут быть использованы в случае необходимости. Примечание: Матрица может быть применен с несколькими различными способами, однако следует отметить, некоторые матрицы, как было установлено совместно кристаллизоваться с желатином, например, феруловая кислота, что делает выборку из строя. Небольшие кристаллы производят более последовательной масс-спектры, что позволяет более видов молекул, чтобы обнаружить и объяснить биологическими различиями, а не матричных эффектов. Применить матрицу методом handspotting. Используйте шприц, с острым концом, чтобы применить 0,5 мкл MATRIX решение на культуре клеток ломтик 3D и позволяют матрица кристаллизоваться. Кроме того, использование метода аэрографом. Заполните аэрограф коммерческого класса с матричного решения. Держите распылитель 8-12 см от слайда, направляйте мелкодисперсную водяную пыль на срез. В перерывах между проходами, позволяют матрица высохнуть в течение 1 мин, чтобы обеспечить лучший образования кристаллов. До 10-20 проходов аэрографа требуется для получения оптимального слой матрицы 22. Кроме того, использование метода сублимации описано в другом месте. 25,27 Сухие скользит в эксикаторе в течение по крайней мере 30 минут до MALDI-MSI, независимо от метода матрицы применения. 25 8. MALDI-MSI анализ с помощью MALDI-TOF системы (т.е. AUTOFLEX III) ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел содержит инструкции и советы по настройке параметров для эксперимента визуализации MALDI-TOF. В зависимости от модулейtrument производителем и программное обеспечение, используемое, процесс может изменяться. Установите слайды в адаптер из прочно удерживать 75 мм х 25 мм слайды с изображением ломтики 3D клеточных культур к слайдам ITO покрытием. Загрузите Слайд-адаптер в инструмент. Подготовьте инструмент для MALDI-MSI, выбрав соответствующий стандарт калибровки для диапазона масс в вопросе. Для опроса малых молекул, обнаруженные сигналы, соответствующие матрицы, используемой, α-CHCA, являются одной общей группы calibrants. Для анализа белков, стандарты известны белка (то есть, убиквитин, Трипсиногена) в массовом диапазоне, представляющем интерес выбраны и заметил рядом с клеточных культур, как 3D calibrants. Калибровка прибора, прежде чем приступить развития метода. До обработки изображений, разработка методов сбора данных для массового диапазоне выбора, используя программное обеспечение, поставляемое заводом-изготовителем прибора. Смотрите рисунки 1 и 2 длямаленькая молекула и изображений белок. Для визуализации небольшой молекулы, использовать рефлектрона режим для самого высокого массового разрешения. Регулировка диапазон масс для получения данных малая молекула между 100-1000 м / г и белков между 8,000- 25000 м / г. Отрегулируйте диапазон масс, чтобы охватить область выбора, обеспечивая высокую массовую возможное разрешение с прибором. Отрегулируйте мощность лазера, частоту, количество лазерных выстрелов и размера пятна, используя калибровочный раствор и рядом "жертвенный" 3D клеточной культуры кусочек. Соблюдайте эти параметры в главном программном обеспечении управления прибором. Используйте следующие настройки в качестве рекомендуемого Отправная точка: 60% мощности, 400 лазерных выстрелов, ультра малый размер пятна. Эти настройки будут варьироваться в зависимости от инструментов и методов, так оптимизировать параметры прибора, чтобы дать высшую спектры качества для каждого конкретного документа. Другие параметры, которые могут быть настроены включают усиление детектора, частота дискретизации и электронный выгоды. Sав этот метод для использования в программном обеспечении обработки изображений (например,., AutoExecute метод, который FlexImaging будет опираться на). Примечание: ионы Подавление ниже массы интересующем диапазоне (опять найти в управления прибором) таким образом, чтобы не мешать обнаружения. Разработка белковые методы сбора данных для массового диапазоне выбора. Выполните те же действия, описанные выше, но для среднего до высокого диапазонов массы, выше примерно 3 кДа, используйте линейный режим. ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки будут отличаться от тех, которые используются для мелких методов молекул. Установить специфичные MS параметры прибора с помощью программного обеспечения, обеспеченные изготовителем прибора, например, FlexImaging для систем Bruker MALDI-TOF. Создайте новый файл изображения и папки, используя методы, разработанные до и сохранены. Выберите параметры прибора, такие как размер растра пятна (изменения значения по умолчанию около 200 мкм до 50 мкм), созданная методом инструментального контроля (настройки в шаге 8.3.2 или 8.3.3), и положеции, где для сканирования по культуре 3D клеток. Выберите три соответствующие точки учить по образцу, двигаясь лазер друг в свою очередь. Получить оптического фотографию с помощью программного обеспечения управления лазером MALDI-TOF с использованием "Print Screen". Примечание: Многие программы для обработки изображений требуют оптического фотографию образца на "учат" программного обеспечения, где находится лазер, который может быть получен с помощью сканера или часто камеры прибора. Затем запустите процесс визуализации с помощью программного обеспечения визуализации (не управления прибором) и приобрести масс-спектры от каждого среза. Соблюдайте большинство масс через культуру 3D клеток и других локализованных в определенных областях. 9. Факультативные данных Методы анализа Для целенаправленного анализа, выполните ручного анализа спектров, нажав на массу в среднем спектра, или позволить ПО для обработки изображений, чтобы автоматически получать массы свыше определенного порога (например., Пики ABОве Top 20% -ный порог). Для контроля качества, изучить распределение матричных пиков или среднее спектр. Выполнить статистический анализ с извлекаемыми наборов данных в программно-математического обеспечения, таких как R или Matlab. Экспорт одного спектры в формате ASCII, в читаемом текстовом файле, для загрузки в программу выбора. Преобразование индивидуальных спектров для ASCII, mzXML, формата mzML для чтения различных компьютерных программ, 28 -. 31 или экспортировать данные в виде Анализ (.img) формате, в общем формате, используемом для других приложений визуализации, такие как МРТ 32 Два варианта с открытым исходным кодом для анализа являются MSiReader и BioMap 32,33. После того, как файлы экспортируются в формат, считываемый с помощью программного обеспечения, загрузите набор данных с помощью инструкции в соответствующем программном обеспечении. После загрузки, выполните обработку после приобретения, такие как удаление исходных условий и нормализации. С этим набором данных, выполните Статиstical методы лечения, такие как анализ главных компонентов иерархической кластеризации с использованием либо пользовательские сценарии или встроенных алгоритмов в таких программах, как Matlab 18.

Representative Results

Изображения MSI имеет потенциал, чтобы выявить многие различные молекулярные распределение в клеточных культурах 3D. Использование метода, описанного выше, виды из небольших молекул (рис 1) до больших белков (фиг.2) может быть отслежены по культуре. Эти результаты показывают, визуализацию отдельного иона с бесплатным инструментом MSiReader. 32 Результаты могут быть проанализированы для одиночных ионов, представляющих интерес через культуру 3D клеток с программным обеспечением визуализации либо в интересующей области или всего отсканированного регионе. Кроме самых программное обеспечение автоматически визуализировать ионы выше определенного порога, установленного пользователем, который может помочь усилия обнаружения. После того, как одиночные карты ионные получаются, большая часть программного обеспечения включает в себя возможность наложения на изображения для просмотра колокализацию ионов. Либо в открытии подходов или в любом моде, изображения масс-спектрометрии является мощным инструментом для анализа клеточных культур 3D. <p class="jove_content" fo:keep-together.в-страницы = "Всегда"> Рисунок 1. Типичные результаты 3D роста клеточной культуры и секционирования. Левых) оптическое изображение из целой ободочной НСТ-116 3D структуры клеточной культуры, если смотреть на 14-й день до сбора урожая. Right) Оптическое изображение приблизительно экваториальной кусочком колоректального 3D оттепели культуры клеток устанавливается на Ито покрытием слайд для работы с изображениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2. Представитель результаты небольшая молекула MALDI-MSI экваториальной части 3D-клеточной культуры. Вверху) Средняя масс-спектры достигается с α-CHCA в малой массы (малая молекула) диапазоне. Внизу) Типичные изображенияодин масса: 327,8 м / з первую очередь локализуется на внутренней части культуры клеток и 3D 429,7 м / з первую очередь локализуется на краю культуры клеток 3D. Пунктирная линия показывает приблизительное край сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3. Представитель результаты визуализации белка MALDI-MSI экваториальной части 3D-клеточной культуры. Вверху) Средняя масса спектров достигается с синаповой кислоты в высокой (в диапазоне от белка) массы. Внизу) Типичные изображения единую массу: 10871 м / з первую очередь локализуется на краю сфероида и 12184 м / з локализованы в большей степени на внутренней части сфероида. Пунктирная линия показывает приблизительное край сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Используя методы, описанные выше, клеточные культуры 3D могут быть выращены и анализировали с MALDI-MSI. Многие увековечили клеточные линии образуют 3D структуры при культивировании надлежащим образом. 9,10 Следует проявлять осторожность, чтобы культивировать клетки, которые закон не был принят слишком много раз, то есть, имеют низкие числа пассажей. В общем, ячейки с числами Прохождение десяти и ниже, являются оптимальными для выращивания клеточных культур 3D. Рост клеточных культур 3D в традиционном агарозном поддержки обеспечивает экономически эффективный способ для исследовательских групп, заинтересованных в 3D культуре клеток, чтобы попытаться эту систему. Этот метод использует несколько компонентов еще не в большинстве клеток млекопитающих культуры лабораторий. Особое внимание должно быть уделено подготовке агарозном пластины для роста, так что клеточные культуры 3D являются однородными по размеру и форме; некоторые аспекты, которые требуют особого внимания, включают проверку того, что пузырьки воздуха не захватываются к смеси и что надлежащее мениск образуется в нижней части каждого масELL. Если мениск не образует образом, клетки могут расти в не-сфероида форм или в небольших комков. Кроме того, следует соблюдать осторожность, чтобы не разместить PBS в желатин с сфероидов. Если это произойдет, удалить PBS из верхней части желатина с использованием 200 мкл пипетки. Если стоимость не является фактором, сверхнизким связывания с круглым дном пластины являются коммерчески доступными и предлагают упрощение этих шагов. В то время как другие методы ткани вложения также может быть дорогостоящим и не-масс-спектрометрии совместимы, желатин-вложение было показано, что как недорогой и универсальный. Подготовка стратегии, описанные выше, были оптимизированы для клеточных культур 3D, чтобы получить высококачественные данные. В то время как желатин-вложение было показано, чтобы быть совместимым с масс-спектрометрического анализа, этот процесс делает сузить доступные матрицы из-за совместной кристаллизации. После того, как замороженные, клеточные культуры 3D являются стабильными в течение нескольких месяцев до тех пор, пока они не вымораживанием оттаивают. Желатин становится непрозрачным при замораживании и 3D клетоккультуры имеют аналогичный цвет, поэтому желательно перед замораживанием для документирования 3D размещение для культивирования клеток, чтобы помочь в нарезку.

При подготовке слайдов, матрица может быть применен с несколькими различными способами, однако следует отметить, что некоторые матрицы, как было установлено совместно кристаллизоваться с желатином, например, феруловая кислота, что делает выборку из строя. Небольшие кристаллы матрицы производят более последовательной масс-спектров. В то время как handspotting является простым способом матрицы применения, больший объем растворителя может привести к более крупных размеров кристаллов и значительный миграционный аналита.

В масс-спектрометре, прогресс в технологии MALDI-MSI уменьшили опыта, необходимого для начала анализа. Сбор и анализ данных проста в большинстве систем, позволяющих даже новичку, чтобы получить качественную информацию из слайдов ITO-покрытием. Тщательный отбор параметров прибора, оптимизированные на близлежащей без изображения достойным 3D КУЛЬТУРА клетокES, имеет решающее значение для получения данных высокого качества. Например, увеличение мощности лазера может увеличить пиковую интенсивность, но сокращается мощность лазера может повысить разрешение и дать более симметричные формы пиков. Культуры клеток 3D должны быть оперативно использованы после нарезки для обеспечения оптимального качества образца. Деградация сигнала белка можно видеть на менее чем за неделю без надлежащего хранения (эксикатор / -80 ° С морозильной), в частности, в области масс высокой (выше 20 кДа). В связи с растущим спросом, много различных программ программного обеспечения визуализации были разработаны и свободно-исследовательского общества. Большинство средств массовой изображений спектрометры установили программное обеспечение, необходимое для визуализации определенной массы с проприетарных форматов, используемых по каждому инструменту. Эти программы могут быть использованы для получения одной массовой изображений и экспорта данных. Большинство программ также позволит наложение двух или более масс интерес. Кроме того, много различных зрители для данных MSI можно загрузить бесплатно, такие как MSiReader апd BioMap 32,33 Данные масс-спектрометрии, полученные также могут быть обработаны после приобретения с легкостью, в результате чего больше полезной информации на первый план..

От фармацевтики до липидов с белками, система описано выше, позволяет для быстрого сбора данных, чтобы оценить распределение молекул, представляющих интерес через 3D структуры клеточной культуры. Серийные срезы могут быть приняты к изображению все 3D структуру путем создания из каждого 2D-изображения среза культуры 3D-клеток. Методы и замечания в протоколе будут полезны для исследователей, желающих начать трехмерную клеточную культуру в качестве моста между монослоя культуры и животных моделях. После того, как освоили эти методы могут быть применены к нескольким типам культур клеток 3D, тканей и клеточных культур, что позволяет исследователям изображение в зависимости от того образцы, которые они выбирают.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments
HCT116 Cell line ATCC ATCC CCL-247 Potential hazard, handle with care
McCoy's 5A media Gibco 16600-108
Fetal Bovine serum HyClone SH30071.03
0.25% Trypsin-EDTA solution Gibco 25200-056
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Phosphate Buffered Saline Gibco 10010049
Gelatin, unflavored Knox — Available at most grocery stores in single-packets
ITO-coated glass slides Delta Technologies, Limited CG-90IN-S115
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)  Sigma-Aldrich C8982
Sinapic Acid Sigma-Aldrich 85429
0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set RoyalMax Airbrush — Many options available on sites such as Amazon.com
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry–looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940 (2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Tags

3D Cell CultureMass Spectrometry ImagingMALDI-MSISample PreparationColon CancerSpheroidsTumor NodulesSpatial AnalysisMolecular Distribution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X., Hummon, A. B. Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models. J. Vis. Exp. (94), e52313, doi:10.3791/52313 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image