다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em> 슈만 편모충</em> 감염 : 간 혈류의 평가
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
생체 내에 현미경 (IVM)을 실시간으로 라이브 동물의 다양한 생물학적 이벤트의 시각화, 모니터링 및 정량을 가능하게 한 강력한 광학 영상 기술이다. 이 기술은 크게 생리적 프로세스 및 특정 기관의 병원체 매개 현상에 대한 우리의 이해를 전진했다.
이 연구에서, IVM은 마우스 간인가하고, 프로토콜 설계 상으로 생체 내 간 순환계를 개별 용기 간 적혈구 (RBC)의 속도를 측정한다. 간 장기 특성을 다른 용기 아형을 시각화 및 혈액 유속 측정을 수행하기 위해 C57BL / 6 마우스에게 정맥 내 간 – 관련 맥관 라벨 형광 플라즈마 시약으로 주입된다. IVM은 관심의 특정 용기 생체 실시간, RBC 속도의 측정에 가능하게한다. 이 방법을 설정하면하는 것이 가능하게됩니다생리적, 병리 적 조건에서 간 혈류 역학 조사. 궁극적으로,이 촬상 계 방법론 L.의 영향을 연구를 위해 중요한 것 간 혈류 역학에 donovani 감염.
이 방법은 다른 감염성 모델 마우스 기관에 적용될 수있다 또한 혈류에 미치는 영향을 정량함으로써 염증에 대한 약물의 효과의 임상 테스트를 미리하도록 확장 될 수있다.
Introduction
장기 별 혈역학는 포유류의 기관의 중요한 생리적 기능입니다. 혈액의 흐름에 이상이 염증의 결과 및 장기 부전 1의 표시 일 수있다. 따라서, 혈류 조직의 구조와 기능은 병리 생리 학적 조건 하에서 분석을위한 임계 파라미터로서 나타난다. 일반적으로 특정 기관에 혈액 흐름을 분석하기 위해 사용 된 기술은 기술 자체의 분해능 한계 등 여러 한계를 포함 (예를 들어 혈류 도플러 촬상) 당 혈액 만 (양의 절대 혈류 측정을위한 용량 기관) (예를 들어, 빛 간섭 단층 촬영)와 혈관 2,3의 크고 이질적인 인구에서 속도의 평균 변화의 측정을 제공하는 장치. 간의 순환 시스템은 크기, 구조와 기능에 이질적인 다른 선박의 하위 유형을 연결합니다. 에이 연구, 생체 내에 현미경 (IVM) 이미징 기술은 고해상도 실시간으로 생체 내 간 혈류 역학을 평가하기 위해 적용되고 평행 간 기관을 구성하는 개별 혈관의 특성을 밝히기 위해서. 이 강력한 광학 이미징 기술의 최근 발전은 연구자가 높은 공간 및 시간 해상도에서 살아있는 동물에서 동적 데이터를 수집 할 수있다. 직접적인 시각화 및 생체 내에서 특이적이고 신속한 생물학적 과정의 실시간 모니터링을 허용함으로써 IVM 이미지 개별 혈관 연구원 수있는 독특한 기회를 제공하고, 측정하고 특별히 선택된 내의 단일 적혈구의 속도 (RBC)를 정량화 간 선박.
본 연구에서 우리는 간에서 혈역학 hepatotropic 슈만 편모충 기생충에 의한 감염 마우스의 영향을 조사하기 위하여 마우스의 간에서 IVM 기법을 구현 하였다. L. donovani내장 리 슈만 편모충 증, 급성 온 만성 염증 반응을 특징으로하는 질환 및 중증 간 및 비장 등의 여러 기관에 존재하는 병변을 담당 에이전트이다. 내장 슈만 편모충 증의 실험 마우스 모델에서 간 감염 자체 해결 비장 감염 4 진보적 인 반면이다. 아직 완전히 이해되지 않은 개별 기관에 대하여 리 슈만 편모충 감염이 결과. 병적 인 상태에서 간 및 비장 혈역학의 조사는 호스트 기생충 상호 작용과 질병 발병 새롭게 조명한다.
우리의 실험 모델 시스템은 노광 및 간 intravasculature의 표지 특정 형광 염료의 정맥 주사를받은 마취 된 마우스의 간을 이미징에 기초한다. 간은 내 생명 현미경 유리한 기관이다. 작은 incisio을 수행 한 후n은 복부, 간은 부드럽게 외부화 된 후 심장 박동과 호흡으로 인해 어떤 모션 아티팩트를 감소시키는 것을 목표로 커버 슬립에 젖은 거즈에 배치합니다. 간 후, 현미경 렌즈의 시야 내에 배치된다. IVM 연구를위한 두 개의 광자 현미경의 사용을 필요로 비장과 림프절에 비해 간암의 이점은 최대 침투 깊이와, 종래의 공 초점 현미경의 사용을 허용 그 균질 3D 구조 / 해부학에 놓여 약 50 μm의, 생체 내에 현미경 영상 5-8합니다.
본 연구는 개개 혈관 RBC 속도와 혈류 속도의 정량적 측정을위한 두 개의 독립적 인 촬상 방법을 설명한다. 첫번째 방법에서, 간 혈류량은 시간 차원 XY 양방향 모드를 사용하여 획득된다. 그 결과 xyt 데이터는 individ의 추적을 허용 무료 ImageJ에 소프트웨어의 MtrackJ 플러그인을 사용하여 분석시간이 지남에 따라 연간 적혈구. 두번째 방법에서, 하나의 혈관이 선택되고, 그 대응하는 혈류는 공 초점 레이저 주사 현미경의 라인 주사 빠른 획득 모드를 사용하여 분석된다. 관심의 용기 축선을 통해 중심 축을 따라 높은 주파수에서 스캔됩니다. 혈액 유속이어서 표지 된 어두운 적혈구와 혈장 사이의 형광 표지 된 콘트라스트의 차이에 기초하여 정량화된다. 스캔 라인을 따라 얻은 적혈구와 혈장의 형광 강도가 줄무늬를 얻는 시간에 대해 도시되고, 각도가있는 개별 RBC의 속도에 비례한다.
이 문서의 목적은 간 개별 혈관 내 이미징을위한 간단하고 재현 가능한 방법 및 측정 혈류 속도를 제공하고, 마우스 수술, IVM 그리고 속도의 정량 분석의 성공적인 성능에 대한 기본적인 도구를 사용할 수 있도록하는 것이다 개별 적혈구. 티그의 접근 방식은 연구자가 병적 인 상태에서 혈액 속도에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 간 생체 내에 현미경의 최근 발전은 생체 내에서 실시간으로 5,9,10 감염에 대한 생리적 반응의 조사에 대한 새로운 가능성을 엽니 다. 장기 혈액의 흐름은 종종 많은 질병에서 변경되는 중요한 생리적 파라미터이다. 그러나 생리 학적 감염성 조건 하에서 간 혈류의 상태를 제대로 탐구 영역 남아있다. 본 연구에서는 이전에 비장 및 종양 맥관 연구를위한 적응시켰다 IVM 기반 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 INSERM, 엑스 – 마르세유 대학과 CL 포레스에 의해 얻어진 HFSPO에서 경력 개발의 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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