Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
Изучение белковых взаимодействий в контексте живых клеток может генерировать критическую информацию о локализации, динамики и взаимодействующих партнеров. Эта информация особенно ценна в контексте хозяин-патоген взаимодействий. Многие белки патогена функционировать в клетках-хозяевах в различных образом, такого как, позволяя уклонения от иммунной системы хозяина и выживание в пределах внутриклеточного среды. Для изучения этих патогенов-белковых взаимодействий клетки-хозяина, несколько подходов обычно используются, в том числе: в естественных условиях заражения штаммом, выражающей с тегами или мутантный белок, или введение генов возбудителя через трансфекции или трансдукции. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки. Мы стремились средство непосредственно ввести экзогенные белки в клетки. Электропорации обычно используется, чтобы ввести нуклеиновых кислот в клетки, но был значительно реже применяется к белкам, хотя биофизических основанием является точно такой же.Стандартный Электропоратор был использован для введения сродством с метками бактериальных эффекторы в клетки млекопитающих. Человеческие эпителиальные и мыши макрофагов Клетки культивировали традиционными методами, удаленные, и помещают в 0,4 см зазор электропорации кюветы с бактериальным патогеном экзогенного белка, представляющего интерес (например, Salmonella Typhimurium GtgE). После электропорации (0,3 кВ) и короткие (4 ч) периода восстановления, внутриклеточный белок был проверен флуоресцентно маркировки белка с помощью своей аффинной метки и изучения пространственное и временное распределение с помощью конфокальной микроскопии. Электропорации белок также показали, чтобы быть функциональным в клетке и способный правильной субклеточном торговли и белок-белкового взаимодействия. В то время как экзогенные белки, как правило, накапливаются на поверхности клеток, электропорации образцы имели значительное увеличение внутриклеточной концентрации эффектор по отношению к инкубации в покое. Протокол является простым и достаточно быстро, чтобы быть сделано в арarallel моды, что позволяет с высокой пропускной характеристике патогенов белков в клетках-хозяевах, включая субклеточном адресности и функции вирулентности белками.
Introduction
Многие грамотрицательные бактерии используют специализированные системы секреции вводить вирулентности связанных белков (так называемые эффекторами) непосредственно в клетках-хозяевах 1-5. Эти эффекторы имеют широкий спектр биологических функций, включая: подавление иммунитета хозяина, изменения цитоскелета, изменение внутриклеточного транспорта и сигнализации, транскрипции изменений, и хозяин протеасомных изменений 6-9. Функции некоторых эффекторов известны, однако хозяева цели и биохимическое действие (ы) и многие другие еще предстоит определить. При сравнении дикого типа и рекомбинантных бактериальных инфекций является действительным подход к изучению внутриклеточных эффекторных механизмов вирулентности, часто выгодно вводить индивидуальный эффектор в клетку-хозяина. Таким образом, простые способы введения и характеризующие бактериальных белков эффекторные в контексте клетках-хозяевах является весьма желательным.
Упрощение анализа экспериментальных Wiй сингл эффектор имеет решающее значение, как и другие эффекторы могут иметь противоположные или избыточных функций. Для достижения этой облегчение, исследователи введенный ранее макромолекул в клетки различных методов, в том числе вирусной трансдукции 10, микроинъекции 11, загрузка путем соскоба 12,13, слияние клеток с химически индуцированного микроинъекции 14, фирменная белок "трансфекции" реагентов 15, фосфат кальция осадков 16 и 17-20 электропорации. Введенные в диапазоне от молекулы нуклеиновых кислот, включая виды ДНК, РНК, и RNAi в белках, клеточных непроницаемый красителей, и антитела для внутриклеточных мишеней 21,22. Некоторые методы имеют ограничения в том числе типа макромолекулы, которые могут быть введены, и конкретные вниз по течению анализ может быть ограничено из-за высокой клеточной токсичности, повреждений механизмами действия, низкой эффективности или эффективности внедрения. Трансфекцию, ofteн-используемый метод для выражения бактериальных генов в клетках млекопитающих, также страдает тем ограничением, что некоторые соответствующие виды клеток-хозяев, таких как макрофаги и первичных клеток, особенно устойчивы к трансфекции. Помимо этого, трудно контролировать уровни бактериального белка, полученного при введении чужеродной ДНК.
Большая работа была создана электропорации нуклеиновых кислот в обоих клетках бактерий и млекопитающих, как общая техника, лаборатории; Однако, проводятся исследования в лучших методов для доставки белков в клетки в физиологических условиях. Отчеты о белковой трансфекции являются перспективными, но требуют дорогостоящих реактивов и оптимизации. Желание ввести потенциально токсичные эффекторы бактериальных в самых разнообразных клеточных мишеней с минимальными затратами привели нас к рассмотрению электропорации в качестве способа для изучения этих белков в естественных условиях.
Белок электропорации 23-25 является встретилHOD ввести белки в живых клетках с помощью electropermeabilization, также известный как электро-трансфекции или электро-инъекции 26. Эта методика использует высокой интенсивности электрических импульсов для создания пор в клеточных мембранах. Эти обратимые поры позволяют макромолекулы, которые обычно исключаются из внутриклеточного пространства проникнуть в клетку. После удаления внешнего электрического поля, мембрана может запечатать, позволяя клетке, чтобы сохранить молекул, которые прошли через поры 27,28.
Стандартный Электропоратор был использован в данном исследовании последовательно ввести бактериальных эффекторы в обоих мыши макрофагами, как клетки и эпителиальные клетки человека. Способ быстрой, эффективной и недорогой, без заметного снижения жизнеспособности клеток. Введенные белки могут быть визуализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии или используется для функциональных анализов. Это было продемонстрировано использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве нетоксичного стандарта, а такжедва Salmonella эффекторные белки, SspH1 и GtgE. Мы предлагаем белка электропорации в качестве дополнительного инструмента в репертуаре для изучения бактериальных белков вирулентности и их функций в эукариотических клетках-хозяевах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Секретируемые эффекторы от патогенных бактерий развивались функционировать в среде клетки-хозяина, и, таким образом, было бы полезно, чтобы изучить их на месте в узле. Введение конкретных эффекторов интерес в клетки-хозяева позволяет соответствующим патогеном-хозяева взаимодейс…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
