A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
O estudo das interações proteína no contexto de células vivas podem gerar informações importantes sobre a localização, dinâmica e parceiros interagem. Esta informação é particularmente valiosa no contexto das interacções hospedeiro-agente patogénico. Muitas proteínas de agentes patogénicos funcionar dentro das células hospedeiras na forma de uma variedade tais como, permitindo a evasão do sistema imunitário do hospedeiro e a sobrevivência no ambiente intracelular. Para estudar essas interações célula-hospedeiro de patógenos em proteínas, diversas abordagens são comumente usados, incluindo: infecção in vivo com uma estirpe que expressa uma proteína marcada ou mutante, ou a introdução de genes de patógenos via transfecção ou transdução. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens. Buscamos um meio para introduzir directamente proteínas exógenas nas células. A electroporação é geralmente utilizado para introduzir ácidos nucleicos em células, mas foi mais raramente aplicado a proteínas, embora a base biofísica é exactamente o mesmo.Um electroporador padrão foi utilizada para introduzir efectores bacterianas de afinidade marcado com em células de mamífero. Macrófagos epiteliais e mouse Humanos foram cultivados pelos métodos tradicionais, individual, e colocados em 0,4 centímetros cuvetes gap eletroporação com uma proteína exógena bacteriana patógeno de interesse (por exemplo, Salmonella Typhimurium GTGE). Após a eletroporação (0,3 kV) e um curto período de recuperação (4 horas), proteína intracelular foi verificada por fluorescently rotulando a proteína através da sua marca de afinidade e examinar a distribuição espacial e temporal por microscopia confocal. A proteína também electroporação mostrou ser funcional no interior da célula e capaz de tráfico subcelular correcta e interacção proteína-proteína. Enquanto as proteínas exógenas tendia a acumular-se sobre a superfície das células, as amostras electroporadas teve grandes aumentos na concentração intracelular de efector em relação à incubação sozinho. O protocolo é simples e rápido o suficiente para ser feito em apmoda arallel, permitindo a caracterização de alta taxa de transferência de proteínas de patógenos em células hospedeiras incluindo segmentação e função das proteínas de virulência subcelular.
Introduction
Muitas bactérias Gram-negativas empregam sistemas de secreção especializados para injetar proteínas relacionadas à virulência (referidas como efetores) diretamente nas células hospedeiras 1-5. Estes efectores têm uma ampla gama de funções biológicas, incluindo: supressão da imunidade do hospedeiro, alterações do citoesqueleto, a modificação do tráfico intracelular e de sinalização, alterações da transcrição, e as alterações de proteassoma hospedeiro 6-9. As funções de alguns efectores são conhecidos, no entanto, os alvos do hospedeiro e de acção bioquímica (s) de muitos outros permanece a ser determinada. Ao se comparar o tipo selvagem e infecções bacterianas recombinantes é uma aproximação válida para estudar os mecanismos de virulência efector intracelular, é muitas vezes vantajoso para introduzir um indivíduo efectora na célula hospedeira. Assim, os métodos simples para a introdução e caracterização de proteínas efectoras bacterianas no contexto de células hospedeiras é altamente desejável.
Simplificar o wi análise experimentalth um único efetor é crítica como outros efetores podem ter funções opostas ou redundantes. Para realizar esta simplificação, os pesquisadores já introduziu macromoléculas em células por muitos métodos diferentes, incluindo a transdução viral 10, microinjeção 11, raspar o carregamento 12,13, fusão celular com microinjeção induzido quimicamente 14, proteína proprietária "transfecção" reagentes 15, precipitações de fosfato de cálcio 16, 17-20 e electroporação. As moléculas introduzidas variam de ácidos nucleicos, incluindo as espécies de ADN, ARN, e proteínas de ARNi a, corantes de células-impermeável, e anticorpos para alvos intracelulares 21,22. Alguns métodos têm limitações, incluindo o tipo de macromoléculas que podem ser introduzidas, e em particular análises a jusante pode ser limitada devido à elevada toxicidade celular, prejudiciais mecanismos de acção, a baixa eficácia, ou eficiência de introdução. A transfecção, uma oftemétodo de n-utilizado para a expressão de genes bacterianos em células de mamífero, também sofre da limitação de que alguns tipos de células hospedeiras relevantes, tais como macrófagos e células primárias, são particularmente resistentes às transfecção. Além disso, é difícil controlar os níveis de proteína bacteriana produzida após a introdução de ADN estranho.
Muito trabalho estabeleceu eletroporação de ácidos nucleicos em ambas as células bacterianas e de mamíferos como uma técnica de laboratório comum; no entanto, há investigação em curso sobre os melhores métodos para a entrega de proteínas nas células sob condições fisiológicas. Relatórios sobre a transfecção de proteína são promissores, mas requerem reagentes e otimização caros. O desejo de introduzir efectores bacterianas potencialmente tóxicos em uma grande variedade de alvos celulares com um custo mínimo nos levou a considerar electroporação como um método para o estudo destas proteínas in vivo.
Electroporação é uma proteína de 23-25 method para introduzir as proteínas em células vivas através electropermeabilization, também conhecidos como electro-transfecção ou electro-injeção 26. Esta técnica utiliza-alta intensidade impulsos eléctricos para criar poros em membranas celulares. Estes poros reversíveis permitir macromoléculas que são normalmente excluídos do espaço intracelular para entrar na célula. Após a remoção do campo eléctrico externo, a membrana pode selar novamente, permitindo que a célula de reter moléculas que passaram pelos poros 27,28.
Um electroporador padrão foi utilizada neste estudo para introduzir consistentemente efectores bacterianas em ambas as células tipo macrófagos do rato e as células epiteliais humanas. O método é rápido, eficiente e barato, sem redução apreciável na viabilidade celular. As proteínas podem ser introduzidos visualizado por microscopia de imunofluorescência ou utilizadas para ensaios funcionais. Isto foi demonstrado utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como um padrão não-tóxicos, bem comoduas proteínas efectoras Salmonella, SspH1 e GTGE. Propomos electroporação proteína como uma ferramenta adicional para o repertório para o estudo de proteínas de virulência da bactéria e das suas funções em células hospedeiras eucarióticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efectores secretadas a partir de bactérias patogénicas evoluíram a funcionar dentro do ambiente da célula hospedeira e, assim, é útil para estudá-los in situ dentro do hospedeiro. Introdução de efetores específicos de interesse em células hospedeiras permite a interação patógeno-hospedeiro relevantes a serem estudados de forma isolada, sem a interferência de outras proteínas bacterianas. O objectivo foi o de explorar a electroporação como um meio para introduzir proteínas efectoras bacteriana…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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