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Médecine

High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d'ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

Published: January 04, 2015
doi:
10.3791/52242
, , , , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology,Iowa State University, 3Biology Program,Iowa State University

Summary

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).

Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.

Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.

Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.

This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Introduction

Un problème majeur avec la mise en œuvre des thérapies utiles pour le traitement des troubles du système nerveux est dans le développement de méthodes efficaces qui empêchent encore la dégénérescence et également faciliter la récupération de la fonction. Une stratégie novatrice est de génétiquement des cellules souches ex vivo ingénieur, pour la production de facteurs neuroprotecteurs, avant leur transplantation. Cette combinaison de la thérapie à base de cellules, associé à un type de thérapie génique, fournit un procédé efficace pour le traitement de la maladie ou la mort neuronale induite par accident dans le système nerveux.

Les facteurs neurotrophiques sont essentiels pour la croissance et la survie des neurones en développement ainsi que la maintenance et la plasticité des neurones matures. Un certain nombre d'études ont démontré un rôle important de facteurs neurotrophiques pour promouvoir la croissance initiale et la différenciation des neurones dans le système nerveux central et périphérique (SNC et du SNP) et ils peuvent également stimuler la régénération in vitro et dans unNimal modèles de lésion nerveuse 1. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) est fortement exprimé dans le système nerveux central et joue un rôle important dans la régulation du développement neuronal, la plasticité synaptique et la réparation deux. Ligne dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF) favorise la survie de plusieurs types de neurones dopaminergiques et notamment les motoneurones 3. Ainsi, une stratégie importante pour la réparation de neurones est de fournir des sources exogènes de facteurs neurotrophiques pour les régions lésées ou malades du système nerveux.

Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse multipotentes (MSC) offrent un grand potentiel pour la livraison de protéines thérapeutiques pour traiter le système nerveux endommagé ou malade. La transplantation de cellules souches mésenchymateuses a attiré une attention considérable dans les efforts visant à développer des thérapies à base de cellules compatibles patients car ils ont un certain nombre d'avantages, y compris, 1) la facilité relative de l'isolement et de la maintenance, 2) capacité multipotentielle, 3) petits préoccupations éthiques, 4) La capacité à survivre et à migrer suite à une transplantation et 5) le potentiel de la transplantation autologue 4,5. Des résultats prometteurs ont été rapportés avec l'utilisation des cellules souches mésenchymateuses naïfs et génétiquement modifiées dans des modèles animaux pour un certain nombre de conditions neurodégénératives, y compris les lésions de la moelle épinière 6,7, 8,9 AVC, l'insuffisance de la myéline 10, et la dégénérescence rétinienne 11-13. Le couplage de la transplantation de cellules avec des facteurs neurotrophiques de livraison à partir de cellules souches génétiquement modifiées est une nouvelle et importante stratégie de réparation neurale.

Une étape essentielle dans le développement de systèmes d'administration de facteur thérapeutique à base de cellules est de déterminer l'état de santé normal des cellules modifiées. Ainsi, le but principal de cette étude était d'évaluer les paramètres de croissance généraux de cellules souches adultes génétiquement modifiées. Une approche importante pour évaluer rapidement les paramètres cellulaires multiples est d'employer cellulaire haute travers screenin à base d'imagesg (HTS), souvent appelé dépistage contenu aussi élevé (HCS) de 14 procédures. Cette technologie permet l'acquisition automatique d'images et l'analyse et cette approche est particulièrement bien adapté pour les applications de recherche sur les cellules souches. Dans ce projet, nous avons développé une plate-forme de profilage qui permet la caractérisation rapide et l'optimisation des préférences de substrat de cellule et fonctions cellulaires avec des cellules souches adultes par génie génétique en utilisant un système HCS.

Protocol

1. Préparation du support pour les plaques à 96 puits Créer une carte de la plaque 96 puits décrivant les différents substrats et types de cellules à examiner (Figure 1). Procurez-vous les solutions de stockage de différents substrats [poly-L-lysine, la fibronectine, collagène de type I, la laminine, et entactine-collagène IV-laminine (ECL)], une plaque de 96 puits à puits multiples et prépare un poste de travail dans une culture cellulaire stérile capot. Préparer substrats individuels par dilution en bouillon stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 5 pg / ml (cette concentration a été précédemment déterminée sur la base d'un essai dépendant de la concentration du substrat pour la croissance et la prolifération de cellules). Mélanger à l'aide d'un vortex avant de verser dans un réservoir stérile. Ajouter 100 pi de solution de substrat dans chaque puits selon la carte 96 puits (Figure 1) (une micropipette de 12 ou 8 canaux est pratique pour micropipetage dans une plaque de 96 puits). Sceller le couvercle de la plaque à 96 puits en utilisant une bande de Parafilm et stocker une nuit à 4 ° C. 2. cellulaire Placage et imagerie time-lapse REMARQUE: Souris MSC ont été isolés à partir de la moelle osseuse des adultes souris C57BL / 6 et maintenu en tant que ligne de cellules adhérentes. MSC ont été infectées en utilisant des vecteurs lentiviraux de les concevoir de sécréter brain-derived neurotrophic factor (BDNF; ADNc humain) et gliale facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF; ADNc humain) en utilisant codant pour le BDNF (LV-BDNF de vecteur lentiviral; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), et la protéine fluorescente verte (GFP, GFP-LV; CMV-GFP). REMARQUE: Milieux de culture de cellules souches mésenchymateuses de souris (MSC) est milieu de Dulbecco modifié par Iscove contenant 10% de sérum d'hybridome qualifié de veau fœtal, 10% de sérum équin, 2 mM de L-glutamine et 10 000 U / ml de pénicilline, 10 mg / ml de streptomycine . Les cinq types de cellules souches mésenchymateuses (CSM de souris, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-M différentsSC et BDNF / GDNF-GFP-CSM) ont été étalées à environ 30% de confluence dans des fioles T75 pour culture cellulaire. Cellule Placage Le lendemain, retirez les solutions de substrat par aspiration et rincer chaque puits avec environ 200 pi de PBS stérile, deux fois. Ajouter milieux de culture cellulaire (200 pl / puits) à chaque puits après le rinçage final PBS. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 pour atteindre l'équilibre. Bien que la plaque à 96 puits est en équilibre dans l'incubateur, récolter les cellules (cellules souches mésenchymateuses dans des flacons T75 devrait être d'environ 70% de confluence au moment de la récolte / placage) en collectant le milieu de croissance (ci-médias conditionné) à partir du flacon T75 et stocker dans un tube conique de 15 ml dans des conditions stériles (ce milieu conditionné est utilisé dans l'étape 2.1.4 ci-dessous). Ajouter 8 ml de PBS stérile dans le flacon et agiter doucement, puis la pipette au large de la PBS et ajouter 1 ml de trypsine à 0,05% et 0,01%solution d'EDTA pour détacher les cellules de la surface de culture du flacon T75. Surveiller détachement cellulaire en visualisant le flacon en utilisant un microscope inversé équipé d'optiques à contraste de phase. Lorsque les cellules ont détaché, immédiatement ajouter 8 ml de milieu conditionné (recueillies à l'étape 2.1.2) dans le ballon. Recueillir la suspension de cellules et les transférer dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et on centrifuge pendant 4 min à 450 x g pour sédimenter les cellules. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 pi de frais et chauffée (37 ° C) des milieux de culture cellulaire. Déterminer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire en effectuant une numération bleu trypan cellules viables en utilisant un hémocytomètre. Plaque les cellules à une densité d'environ 300 cellules / puits dans les puits appropriés de la plaque de 96 puits. Répétez ces étapes pour chaque population de cellules. Imagerie time-lapse Une fois que tous les MSC ont été plaqués, lieula plaque à 96 puits dans un incubateur pendant 2 heures pour permettre aux cellules souches mésenchymateuses pour fixer au substrat. Démarrez le système HCS et attendre 2 heures pour le système de se équilibrer. Régler le dispositif de commande de l'environnement de 37 ° C et connecter une bouteille de gaz mixte contenant 5% de CO 2 dans l'air de la chambre climatique HCS système fournissant une source d'air constant. Retirer la plaque de 96 puits de l'incubateur après la période d'équilibrage de 2 h et placer directement dans la chambre du système HCS de la croissance cellulaire. Laisser 30 minutes pour atteindre l'équilibre pour tenir compte de toute expansion liée à la chaleur de la plaque et puis démarrez le logiciel d'acquisition et d'analyse d'image pour configurer les paramètres de la plaque. Sélectionnez l'objectif 20X pour l'imagerie. Sélectionnez deux puits par condition [c.-à-GFP-MSC sur la fibronectine, etc. (6 x 5 substrats sous-type du MSC pour un total de 30 conditions x 2 = 60 répétitions puits au total)] pour la mise en place imagerie time-lapse. Choisissez deux sites pour l'imagerie avecdans chaque puits. Choisissez les longueurs d'onde de lumière correctes pour l'imagerie. REMARQUE: Deux longueurs d'onde différentes (phase de contraste et de fluorescence de la GFP) ont été sélectionnés pour l'imagerie time-lapse. Focus sur le fond du puits avec l'autofocus laser et prendre des images de test pour plusieurs sites et plusieurs puits pour trouver un plan focal optimisé. Une fois que l'accent a été mis en place, commencer à capturer des images toutes les 5 minutes pendant 48 heures pour tous les 60 puits (120 sites). Nourrir les cellules toutes les 24 heures en retirant la plaque 96 puits du système HCS. Retirer 75 ul de milieu de chaque puits et ajouter 100 ul de milieu frais à chaque puits (équilibrer ce média frais à 37 ° C et 5% de CO 2). À la fin de l'expérience time-lapse, retirez la plaque de 96 puits du système HCS. Dans des conditions stériles, recueillir les échantillons de milieu conditionné provenant de chaque puits et transférer ces échantillons à un autre plaque de 96 puits. NOTE: Ces échantillons peuvent être utilisés pour d'autres analysest en effectuant ELISA pour des facteurs neurotrophiques. Préparer la plaque 96 puits avec CSM cultivées pour des tests supplémentaires tels que dosage de la prolifération des cellules Ki67 ou l'iodure de propidium morts dosage direct / de coloration (voir détails ci-dessous). Effectuer l'analyse d'imagerie time-lapse pour la cellule suivi la migration / cellulaire comme décrit dans la section 5 ci-dessous. 3. Ki67 prolifération cellulaire et de l'iodure de propidium Live / Assay Morte Ki67 prolifération cellulaire Assay (immunocytochimie) Rincer les cultures de cellules avec 0,1 M de phosphate (PO 4) du tampon pendant une minute à deux reprises. Fixer la culture avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Retirez la PFA et rincer les puits avec du PBS pendant sept minutes trois fois. Après le rinçage final, ajouter 100 ul de solution de blocage (solution saline de phosphate tampon, 5% de sérum de âne normale, 0,4% de sérum albumine bovine et 0,2% de Triton X-100) dans chaque puits d'unee incuber à température ambiante pendant 1 heure. Préparer l'anticorps primaire de lapin anti-Ki67, par dilution dans une solution de blocage à un rapport de travail de 1: 200. Retirer la solution de blocage et d'appliquer 100 ul de la solution d'anticorps primaire à chaque puits. Couvrir la plaque à 96 puits et incuber les échantillons à 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain, retirez la solution d'anticorps et rincer avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Préparer l'anticorps secondaire, l'âne anti-lapin Cy3 dans une solution de blocage à un rapport de travail de 1: 500. Ajouter colorant nucléaire DAPI à la solution d'anticorps secondaire à une dilution de 1: 100. Après élimination du dernier rinçage du PBS, 100 ul d'appliquer la solution d'anticorps secondaire / DAPI à chaque puits. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 90 min. Retirer la solution secondaire d'anticorps / DAPI et rincer chaque puits avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Recouvrir la plaque 96 puits et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. PropiDIUM iodure Live / Assay Morte Mesurer la mort des cellules par l'iodure de propidium (PI) un dosage d'exclusion comme décrit ci-dessous. Préparer la solution de colorant iodure de propidium à une concentration de 1,5 uM dans du milieu de culture. Ajouter 100 ul d'éthanol à 70% à un puits de la MSCs pendant 2 min dans le but de tuer ces cellules. Ce puits sert de contrôle positif pour la tache de PI. La majorité de la PI MSC sera taché indiquant la mort cellulaire. Retirer la solution d'éthanol. Ajouter 100 ul de solution de colorant iodure de propidium à chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Rincer les cellules avec du tampon de phosphate 0,1 M pendant 1 min, deux fois. Fixer les cellules avec 4% de PFA dans 0,1 M de tampon P0 4 pendant 20 min à température ambiante. Retirez la PFA et rincer avec du PBS à trois reprises pendant 7 min. Incuber avec une solution de DAPI (1:50) dilué dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. Rincez tous les puits avecPBS pendant 7 min, 3 fois. Retirer la solution DAPI et rincer chaque puits avec du PBS pendant 7 min, 3 fois. Recouvrir la plaque 96 puits et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. 4. Analyse Automated Imaging et Multiwavelength notation Chargez une plaque de 96 puits (précédemment traitées pour Ki67 immunomarquage ou l'iodure de propidium teinté) dans le système HCS et laisser la plaque se équilibrer pendant 20 min Ouvrez l'acquisition et l'analyse de l'image système logiciel HCS. Choisissez les paramètres d'acquisition pour l'objectif 10X en utilisant la caméra binning à 1 et un réglage de gain de 2. Trouvez la Z-plan dans lequel les cellules se trouvent en utilisant la fonction d'exposition automatique et de calculer le décalage pour chaque longueur d'onde d'intérêt. Pour cette analyse, des images de capture pour DAPI (W1), Cy3 (W2), et FITC (W3). Choisissez le niveau d'intensité maximale à laquelle les puits de contrôle négatif ne montrent pas de signal pour l'acquisition d'images. Confirmez ce paramètre est approprié pour la pospuits itive. Acquérir plaque. Capture d'images et de les stocker dans l'acquisition de l'image et la base de données de logiciels d'analyse. Une fois les images ont été acquises, image ouverte acquisition et d'analyse de logiciels en ligne et l'examen des données de plaque les images acquises précédemment. Sélectionnez l'analyse de notation multi-longueur d'onde. Configurez le minimum et intensités maximales pour chaque longueur d'onde. Remarque: La détection de DAPI devrait marquer la coloration autour de chaque noyau visible. Cy3 doit détecter les cellules positives à Ki67 immunoréactivité (IR) et ne doit pas détecter IR dans les témoins négatifs. Pour Cy3 Ki67 IR, la largeur minimale est d'environ 7 pm, la largeur maximale approximative est de 30 pm, l'intensité au-dessus du fond local était de 150 niveaux de gris, et la zone tachée du minimum est de 50 pm 2. Exécuter l'analyse pour tous les postes. Exporter les données à afficher dans un tableur. Suivi 5. cellulaire Ouvrir l'image ACQUISITIOn et programme d'analyse et cliquez sur «Examiner les données des plaques [DB] …", en sélectionnant la plaque d'intérêt. Voir les données comme "Time vs Eh bien". Choisissez un des sites de la section "Sites" par un clic gauche sur la sélection souhaitée. Sélectionnez "Transmis …" dans les "longueurs d'onde:". Faites un clic droit sur la cible et dans le modèle de plaque de 96 puits et cliquez sur «Charger les images". Suivre les cellules en cliquant sur les "Applications", puis "suivre des objets". Utilisez "Dynamic Data Exchange (DDE)" pour choisir le format d'exporter les données, par exemple, Microsoft Excel. Choisissez les données de suivi à l'exportation, par exemple, temps écoulé, nombre d'objets, la distance, intervalle de temps, vitesse, angle absolu, la distance à l'origine, delta x et y delta. Marquer chaque cellule d'intérêt avec "touche Ctrl + clic gauche" sur les cellules cibles. cellules de piste. Si nécessaire, arrêter / modifier suivi inadéquat des cellules avec la touche "Esc", puis régler les paramètres. Après un suivi de la cellule est complète, enregistrer des données avec "Log Data".

Representative Results

Les paramètres de croissance MSC ont été examinés par la culture des différentes populations de cellules souches mésenchymateuses sur différents substrats. Les cinq populations différentes de sous-types MSC (MSC, GFP-MSC, le BDNF-GFP-MSC, le GDNF-GFP-MSC, et BDNF / GDNF-GFP-CSM) ont été étalées dans des plaques à 96 puits de culture de tissu pré-revêtues de l'autre substrats comme représenté sur la figure 1. Au bout de quatre jours de culture, les plaques ont été fixées et immunomarquées et / ou colorées avec des réactifs appropriés et ensuite examinées en utilisant le système HCS et des analyses effectuées avec l'acquisition d'image et un programme de logiciel d'analyse. Figure 1:. À 96 puits de la plaque modèle expérimental pour la conception des plaques à 96 puits ont été revêtues avec différents substrats et les puits ont été ensemencées avec des cellules souches usinés comme représenté dans le modèle. A titre d'exemple, seulement wells BF dans les rangées ont été utilisés dans cette expérience. Lignes A, G et H ont été laissés vides. Abréviations – MSC: les cellules souches mésenchymateuses; GFP-MSC: MSC exprimant la protéine verte fluorescente; BDNF-GFP-MSC: dérivé du cerveau MSC facteur exprimant la GFP neurotrophiques; GDNF-GFP-MSC; Gliale cellulaire dérivé MSC facteur exprimant la GFP neurotrophiques; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF et GDNF MSC exprimant la GFP; ECL: entactine-collagène IV-laminine). Anti-Ki67 immunomarquage, suivie par contre-coloration au DAPI, a été utilisé pour évaluer si les différents substrats influencés prolifération des différentes populations de cellules souches mésenchymateuses modifiées (Figure 2A). Expression de l'antigène Ki67 produit préférentiellement au cours des phases tardives G 1, S, G2 et M du cycle cellulaire, et ne est pas détectée dans les cellules dans la phase de repos (G 0), et est donc utile en tant que marqueur cellulaire pour la prolifération 15 . 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisée par un nuContre claire et chromosome qui émet une fluorescence bleu lors de la liaison à AT régions de l'ADN 16. Le nombre total de cellules dans un champ peut être déterminée en comptant le nombre de noyaux colorés au DAPI. Comme illustré sur la figure 2B, bien qu'il y avait une variation dans les pourcentages de cellules souches mésenchymateuses qui prolifèrent, tous les substrats supportés néanmoins la prolifération cellulaire considérable pour chacun des sous-types de MSC. Figure 2: analyse de prolifération de cellules Ki67. (A) issu de la fusion, l'image double fluorescent de Ki67 immunomarquage (rouge) et DAPI (bleu) coloration nucléaire. Un grand nombre de cellules souches mésenchymateuses ont été immunomarquées avec l'anticorps Ki67 (rouge). Barre d'échelle = 50 pm. (B) graphe en barres illustrant le pourcentage des sous-types de Ki67 immunomarquées MSC cultivées sur du polystyrène (PS), les poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, le collagèneType I, la laminine, le collagène ou l'entactine-IV-laminine (ECL) substrats pendant 5 jours in vitro (DIV). N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne des données regroupées à partir de 8 sites imagées de deux puits pour chaque condition. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. L'iodure de propidium (PI) a été utilisé pour la coloration évaluer si différents substrats influencé la survie des cellules (figure 3). L'iodure de propidium est un chromosome nucléaire et contre-coloration rouge fluorescent couramment utilisé. L'iodure de propidium est imperméant de la membrane et généralement exclu de cellules viables, et donc est utile pour détecter des cellules mortes dans une population. La proportion de cellules mortes dans un état donné peut être déterminée lorsqu'il est combiné avec un marqueur nucléaire DAPI général tel que pour identifier toutes les cellules dans un champ. Le pourcentage de cellules PI positif était faible sur tous les substrats examinés (Figure 3). Comme témoin positif pour le réactif de PI, quelques puits contenant des cellules souches mésenchymateuses ont été incubées dans 70% d'éthanol, une condition connue pour tuer la plupart des cellules, résultant en un pourcentage élevé de cellules PI marqué comme illustré sur la figure 3B et 3C (éthanol traitée positif contrôle). Figure 3: iodure de propidium dosage de mort cellulaire. (A) issu de la fusion, double image fluorescent pour l'iodure de propidium (rouge) et DAPI (bleu) coloration. Bien que les noyaux de toutes les cellules viables ont été colorées avec du DAPI (bleu), aucune coloration iodure de propidium a été détecté dans le MSC. (B) pratiquement tous les MSC ont été colorées avec de l'iodure de propidium après exposition à 70% d'éthanol. Barres d'échelle de A et B = 100 um. sous-type MSC (C) Bar graphique illustrant les pourcentages de l'iodure de propidium (PI) tachés cultivés sur du polystyrène (PS), le poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, le collagène de type I, la laminine, le collagène ou l'entactine-IV-laminine (ECL) substrats pendant 5 jours in vitro (DIV). Contrôle Ethanol: Cette condition a servi de témoin positif pour le réactif de coloration PI. La plupart des cellules soumises à un traitement de l'éthanol PI taches suivantes sont morts et donc colorées positivement pour le réactif de PI. N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne des données regroupées à partir de 8 sites imagées de deux puits pour chaque condition. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pour étudier l'influence possible des différents substrats sur le comportement des cellules souches mésenchymateuses ingénierie, la migration cellulaire a été analysé en utilisant la microscopie numérique time-lapse et le système lumière transmise / chambre environnementale sur le système HCS (voir vidéo supplémentaire 1). Plusieurs sites / puits ont été time-lapse imagéset utilisé pour calculer les taux de migration de cellules pour les différentes sous-populations de cellules souches mésenchymateuses qui poussent sur les différents substrats en utilisant le logiciel d'acquisition et d'analyse d'image. En général, comme représenté sur la figure 4C, les sous-types de cellules souches mésenchymateuses ont montré que le taux de migration la plus rapide sur les surfaces de la matrice extracellulaire (revêtues de fibronectine, le collagène, la laminine et ECL) et le plus lent sur ​​des surfaces non revêtues de polystyrène. Figure 4:. Suivi et la migration cellulaire MSC suivis avec l'acquisition de l'image et des logiciels d'analyse. Images qui interfèrent de la lumière transmise et de fluorescence images de (A) le début de l'imagerie time-lapse et (B) à 29 heures plus tard à la fin de la session d'imagerie time-lapse (voir vidéo supplémentaire 1). pistes de migration cellulaire sont indiqués par la li couleurnda. Barre d'échelle:. 50 pm (C) Bar graphique illustrant les taux de migration moyenne (exprimée en um / h) pour les sous-types de MSC augmenté de polystyrène (PS), le poly-L-lysine (PLL), la fibronectine, collagène de type I, la laminine, ou entactine-collagène IV-laminine (ECL) substrats pour deux jours in vitro (DIV). N = une expérience. Chaque barre représente la moyenne d'au moins 10 cellules imagées à partir de deux puits pour chaque condition. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pris ensemble, ces résultats fournissent des preuves préliminaires que ces sous-populations de cellules souches mésenchymateuses génétiquement modifiés présentent des propriétés de croissance similaires. Ces résultats fournissent des preuves convaincantes que le lentivirus médiée modifications génétiques de ces MSC n'a induit aucun effet délétère détectables dramatiques sur les paramètres de croissance étudiés en utilisant cette plate-forme de criblage. <p class= "Jove_content"> Vidéo supplémentaire 1. Time-lapse vidéo numérique de suivi MSC en utilisant le logiciel d'acquisition et d'analyse d'image. Le chemin de migration est pour deux MSC [indiqués comme 1 (ligne de repérage vert) et 2 (ligne bleue de suivi)] sont illustrés. La vidéo prise pendant une période de 29 h. Les images ont été capturées toutes les 5 min. Des images de fluorescence de cellules souches mésenchymateuses exprimant la GFP a été utilisée pour l'imagerie time-lapse dans la préparation de la vidéo. barre de calibrage = 50 um. Ce type d'analyse est utile pour étudier les comportements cellulaires, y compris la migration cellulaire et la division cellulaire.

Discussion

Les cellules souches adultes mésenchymateuses (CSM) sont un type de cellule attrayant pour le développement d'une stratégie expérimentale combinant une thérapie cellulaire et génique basée livraison. MSC sont multipotentes, capables de se différencier en cellules de la lignée mésodermique, et affichent plasticité, différenciation / transdifferentiating en lignées neuronales et gliales avec l'induction appropriée paradigmes 17,18. En outre, les CSM ont été transplantés et prouvé son efficacité dans des études précliniques pour un certain nombre de troubles, y compris les conditions neurodégénératives 19. L'efficacité thérapeutique de cellules souches mésenchymateuses est bien connu en raison de leurs propriétés anti-prolifératives, les activités bénéfiques des anti-inflammatoires et anti-apoptotiques 20. MSCs sont également connus pour produire et sécréter de divers facteurs neurotrophiques et de croissance, ce qui contribue probablement les qualités neuroprotectrices associés aux cellules souches mésenchymateuses naïfs après transplantation à des sites de lésion ou d'une maladie 21. Importantly, MSC peuvent être génétiquement modifiés pour la livraison soutenue de facteurs neurotrophiques pour les applications à base de thérapie cellulaire et de gènes combinés et ont été utilisés dans un certain nombre de modèles animaux de blessure ou de maladie du SNC 11,19,22.

Lors de l'élaboration d'une stratégie combinée à base de thérapie cellulaire et génique, il est important que la santé des cellules est évaluée avec soin avant leur utilisation extensive pour in vitro, et en particulier dans les applications in vivo. Comme une preuve de concept, nous avons étudié plusieurs populations de lignes d'ingénierie et de contrôle MSC afin d'étudier les conséquences des modifications génétiques sur la santé et la forme physique de la cellule en utilisant une approche de dépistage teneur élevée (HCS). En général, HCS se réfère à base d'images cellulaire criblage à haut débit 14. Cette approche de dépistage permet une évaluation quantitative des phénotypes cellulaires à plusieurs niveaux de l'espace (cellulaires pour subcellulaire) et temporelles (millisecondes à jour) resolution dans diverses conditions expérimentales. En utilisant cette approche, nous accédé éventuelles différences de préférence de substrat sur les paramètres suivants: la prolifération cellulaire, l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP), la mort cellulaire, la motilité cellulaire et / migration. Des expériences ont été conçues en format de plaque de culture cellulaire à 96 puits. Dans une seule plaque nous systématiquement étudié les différences possibles liées substrat à l'égard de chaque paramètre pour les différentes populations de cellules MSC lentivirus transduction et comparé les MSC ingénierie avec l'original, CSM non-transduites. Cela a fourni un moyen de comparer directement les résultats pour les différents sous-types de MSC avec une batterie de tests in vitro tels que la prolifération cellulaire en utilisant Ki67 immunomarquage, morts dosage direct / de la viabilité des cellules en utilisant l'iodure de propidium et le comportement des cellules en effectuant l'imagerie numérique time-lapse . Dans le prolongement de cette HCS on peut également effectuer des tests ELISA sur des échantillons de milieux conditionnés recueillies auprès individuelle waunes de déterminer quantitativement la sécrétion de facteurs neurotrophiques. Le milieu conditionné provenant de différents sous-types de MSC peut également être utilisé dans des essais biologiques in vitro pour déterminer l'activité biologique de facteurs sécrétés 11,23. Ce type de plate-forme HCS peut également être utilisé pour des mesures in vitro de la croissance des neurites à partir de cultures de neurones primaires et des lignées de cellules neuronales souches 24. Dans l'ensemble, nos résultats ont démontré que les sous-populations de cellules souches mésenchymateuses génétiquement modifiées les affichent des comportements similaires en comparaison avec les cellules souches mésenchymateuses non modifiés. L'influence de divers substrats de culture sur la croissance cellulaire et la migration cellulaire ne était pas considérablement différente entre les sous-types de MSC, ainsi que des substrats de culture. En tant que tel, les substrats de la matrice extracellulaire testés ne semblent jouer un rôle essentiel dans la modulation de ces aspects du comportement cellulaire pour ces différents MSC ingénierie.

Cette étude démontre l'utilisation d'un système d'analyse pour HCS différent aspects du comportement cellulaire. Cependant, il ne est pas rare de rencontrer des limitations associées à l'analyse d'images. À l'occasion, tout en analysant les images de fluorescence, ce était un peu difficile de déterminer la valeur de seuil au-dessus duquel correcte immunomarquées ou cellules colorées seraient comptés comme positive marquée / teinté. Ainsi, pour minimiser le biais subjective, la détermination de valeurs de seuil est dépendant d'une comparaison avec des témoins (témoins négatifs pour l'imagerie de fluorescence ont été effectuées en parallèle pendant tout le traitement par l'omission des anticorps primaires ou secondaires). Une autre limitation a été rencontrée lors de l'analyse de la migration cellulaire en utilisant l'imagerie numérique lapse. Dans certains cas, le logiciel d'imagerie ne était pas en mesure de différencier entre le mouvement brownien aléatoire d'une cellule contre une cellule fait migrer seulement une très courte distance. Limitations supplémentaires étaient évidentes dans les situations où le logiciel d'analyse ne était pas en mesure de distinguer la présence de multipLe à cellules très près à un autre. Pour surmonter cette sélection cellulaire manuel de prescription requise lors de l'analyse plutôt que l'analyse totalement automatique. La densité cellulaire de placage peut également entraîner biaiser les données de migration cellulaire entre les populations de cellules qui présentent une plus grande préférence à croître en touffes par rapport aux cellules qui se développent dans l'isolement les uns des autres. Ces types de différences sont en partie probablement un reflet de la cellule-substrat en fonction des préférences de cellule à cellule.

Utilisation d'un système de HCS à acquérir des images et effectuer une analyse de données fournit un moyen efficace et rapide pour évaluer plusieurs paramètres de maille. En outre, vidéos numériques time-lapse pour 30 différentes conditions (6 substrats et cinq sous-types de différentes MSC) ont été régulièrement acquis pour des périodes allant de quelques heures à quelques jours (48 h) tout en utilisant la chambre de l'environnement. Ces données ont été ensuite utilisées pour calculer et déterminer les différences dans les taux de migration des cellules à travers diverses lignées cellulaires sur ECM différentemolécules.

Dans ce rapport, nous avons mis en évidence la mise en œuvre d'une plateforme de criblage à haute teneur pour évaluer la santé et la fonction cellulaire. Ce type d'analyse est utile pour développer des stratégies rationnelles pour la conception de types de cellules, ainsi que les substrats polymères pour faciliter la croissance cellulaire et la régénération neurale dirigée. Ce est une étape essentielle vers l'application de la livraison à base de cellules souches de facteurs thérapeutiques avant vaste dans les études précliniques in vivo en utilisant des stratégies de transplantation cellulaire.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materials

96 well plates Greiner Bio One 655090 96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody Abcam (Cambridge, MA) Ab16667 1:200 dilution
Collagen type I Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) C7661 Collagen from rat tail
DAPI Invitrogen (Carlsbad, CA) D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3 Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  711-165-152 1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) Millipore/Chemicon (Temecula, CA) 08-110
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Logan, UT) SH30071.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
Ethanol Chemistry Store (Ames, IA) 12003510 100%, 200 proof
Fibronectin Fisher Scientific (Hampton, NH) CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
KH2PO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P285 For PO4 buffer
K2HPO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P288 For PO4 buffer
L-Glutamine Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) 25030-081
Laminine (mouse) Trevigen (Gaithersburg, MD) 3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS) Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  017-000-121
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific (Hampton, NH) O4042 4% PFA in 0.1M PO4 buffer
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4417
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4707
Propidium iodide (PI) Invitrogen (Carlsbad, CA) P1304MP
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) Invitrogen (Carlsbad, CA) 25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium Invitrogen (Carlsbad, CA) 12440–046
Hybridoma-qualified FBS Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
ImageXpress Micro Molecular devices (Sunnyvale, CA) ImageXpress micro High content screening system
MetaXpress 4.0 Molecular devices (Sunnyvale, CA) MetaXpress 4.0 Image acquisition and analysis software
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References

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Citer Cet Article
Sharma, A. D., Brodskiy, P. A., Petersen, E. M., Dagdeviren, M., Ye, E., Mallapragada, S. K., Sakaguchi, D. High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies. J. Vis. Exp. (95), e52242, doi:10.3791/52242 (2015).
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