Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para<em> In Vitro</em> Ensayos de mielinización

La mielinización de los axones es crucial para la transmisión rápida y eficaz de los potenciales de acción en los sistemas nerviosos central y periférico. Las células especializadas, las células de Schwann en el sistema nervioso periférico y los oligodendrocitos en el sistema nervioso central, y se envuelven alrededor de los axones en ensheathe mielina, aislantes efectivamente el nervio y que facilitan la conducción saltatoria ^1. El proceso de mielinización puede ser estudiada in vitro usando las neuronas ganglionares de la retina ^2, nanofibras de ingeniería ^3, o neuronas ganglionares de la raíz dorsal co-cultivadas con células de Schwann o ⁴ oligodendrocitos ^5-7. El ensayo de mielinización in vitro es un modelo establecido para el estudio de la mielinización del sistema nervioso y se replica muchos de los procesos fundamentales que ocurren durante la mielinización in vivo ^5-8. El ensayo consiste en la co-cultivo de las poblaciones purificadas de Ganglio de raíz dorsal (GRD) neuronas, con los OPC (para CNS mielinización) o células de Schwann (por PNS mielinización). En condiciones específicas de estas células mielinizantes ensheathe axones DRG en la ordenada y ultra verificado estructuralmente, hoja multi-lamelar de aislante membrana plasmática que expresan el mismo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo.

El modelo de célula más comúnmente utilizado de estudiar la mielinización del SNC in vitro es el co-cultivos de neuronas DRG y OPC, que han sido utilizados con éxito para estudiar el efecto que los factores exógenos tales como las neurotrofinas ejercen sobre la mielinización del SNC in vitro ^5,6. Los factores exógenos tales como factores de crecimiento o inhibidores farmacológicos de moléculas pequeñas se han utilizado ampliamente para estudiar el papel de vías de señalización en la mielinización utilizando el DRG-OPC modelo de cocultivo ^7,9. Sin embargo, en la configuración de co-cultivo mixto que contienen tanto las neuronas y oligodendrocitos, se mantuvo formalmente posible que cualquiera de los factores de crecimiento o la pharinhibidores macológico podrían haber ejercido efectos en tanto las neuronas y oligodendrocitos (OL) DRG. Este sí ofrece la capacidad de diseccionar específicamente las funciones que las proteínas expresadas únicamente por GRD o oligodendroglia ejerce sobre la mielinización utilizando este sistema celular dual. Para confirmar inequívocamente que la vía de señalización en oligodendroglial regula directamente la mielinización, la transducción lentiviral de OPC, antes de sembrar en las neuronas DRG para el ensayo de mielinización in vitro, ha demostrado ser una manera elegante de sobreexpresan tanto de tipo salvaje y las proteínas mutantes, así como expresión desmontables de proteínas constitutivamente expresadas por los oligodendrocitos. Así, este enfoque ofrece una vía para interrogar y manipular las vías de señalización dentro de los oligodendrocitos para el estudio de la mielinización ^9,10 específicamente.

En este artículo analizamos los métodos que hemos desarrollado para sobreexpresan una proteína de interés de forma selectiva en los oligodendrocitos a través de un lentiviralenfoque para el estudio de la mielinización in vitro. La técnica comienza con la generación de vectores de expresión que contienen el gen de interés, ya sea en un tipo salvaje, forma negativa constitutivamente activa o dominante que luego se clonó posteriormente en el vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (que contiene el gen de interés), el donante promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) y el lentivector 2K7 se combinan en una reacción enzimática para producir un vector que contiene el promotor CMV 2K7, el gen de interés, una sitio interno de entrada ribosomal y las buenas prácticas agrarias (Figura 1). Este constructo clonado 2K7 puerta de enlace combinada con la envoltura del virus PMD2.G y el paquete de virus pBR8.91 se puede co-transfectadas en células HEK293T para generar lentivirus que posteriormente se puede usar para transducir OPC. Una vez infectado con el lentivirus los OPCs expresan un alto nivel de la proteína de interés. Estos OPC pueden ser sembradas en cultivos de neuronas DRG y el efecto que la expresiónde altos niveles de la proteína deseada ejerce sobre la mielinización puede ser interrogado. Los co-cultivos se evaluaron para la expresión de proteínas de mielina por análisis de transferencia Western y se visualizaron para la formación de segmentos axonales mielinizadas por inmunocitoquímica.