Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для<em> In Vitro</em> миелинизации Анализы

Миелинизации аксонов имеет решающее значение для быстрого и эффективного передачи потенциалов действия как в центральной и периферической нервной систем. Специализированных клеток, шванновских клеток в периферической нервной системе и олигодендроциты в центральной нервной системе, обернуть вокруг и ensheathe аксоны в миелина, эффективно изолирующих нерв и облегчающие сальтаторных проводимость ^1. Процесс миелинизации могут быть изучены в лабораторных помощью сетчатки ганглиозных нейронов ^2, инженерные нановолокон ³ или задних корешков ганглиев сокультивировали либо с клетками Шванн ⁴ или олигодендроцитах ^5-7. В пробирке миелинизация анализ является известной моделью для изучения нервной системы миелинизации и она повторяет многие из фундаментальных процессов, которые происходят во время миелинизации в естественных условиях ^5-8. Анализ включает совместного культивирования очищенных популяций спинных ганглий (DRG) нейронов, с OPCs (для CNS миелинизация) или Шванн клетки (для ПНС миелинизации). При определенных условиях эти myelinating клетки ensheathe DRG аксоны в упорядоченной, ультра структурно проверены, мульти-пластинчатые листа изолирующего клеточную мембрану, что выразить одинаковый набор миелиновых специфических белков, присутствующих в естественных условиях.

Наиболее часто используется сотовый модель изучения ЦНС миелинизации в пробирке является со-культуры DRG нейронов и OPCs, которые были успешно использованы для изучения влияния, что экзогенные факторы, такие как нейротрофинов оказывают на ЦНС миелинизации в пробирке ^5,6. Внешние факторы, такие как факторы роста или низкомолекулярных фармакологических ингибиторов широко используется для изучения роли сигнальных путей в миелинизации с помощью DRG-OPC Совместное культивирование модели ^7,9. Тем не менее, в случае смешанных со-культуры, которые содержат как нейроны и олигодендроциты, она по-прежнему формально можно что либо факторы роста или Pharmacological ингибиторы могли оказать воздействие на обоих нейронов DRG и олигодендроциты (ПР). Это действительно предлагает способность специфически вскрыть роль, что белки, выраженные только ДРГ или олигодендроглии оказывает на миелинизации с помощью этой системы двойной клеток. Однозначно подтверждают, что сигнальный путь в олигодендроглиальных непосредственно регулирует миелинизация, лентивирусный трансдукция OPCs, перед посевом на DRG нейронов для в пробирке миелинизации анализа, оказалась элегантный способ сверхэкспрессировать как дикого типа и мутантных белков, а также как нокдаун экспрессии конститутивно экспрессированных белков по олигодендроцитах. Таким образом, этот подход дает проспект специально опроса и манипулировать сигнальными путями внутри олигодендроцитах для изучения миелинизации ^9,10.

В этой статье мы приводим методы, которые мы разработали для сверхэкспрессии представляющего интерес белка выборочно в олигодендроцитах с помощью лентивирусногоподход к изучению миелинизации в пробирке. Методика начинается с генерации векторов экспрессии, содержащих нужный ген, будь то в дикого типа, конститутивно активным или доминирующей негативной форме, которые затем последовательно клонировали в вектор pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Этот вектор (содержащий интересующий ген), ЦМВ промотор донора (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) и 2K7 lentivector объединены в ферментативной реакции с получением 2K7 вектор, содержащий промотор CMV, интересующий ген, Внутренняя рибосомальной сайт вход и GFP (рис 1). Этот шлюз клонировали 2K7 конструкция в сочетании с вирусной оболочки PMD2.G и вирус пакета pBR8.91 могут быть совместно трансфицировали в клетки HEK293T генерировать лентивирус, которые впоследствии могут быть использованы для трансдукции OPCs. После заражения с лентивирусов в OPCs выражают высокий уровень белка, представляющего интерес. Эти OPCs затем могут быть посеяны на DRG нейронов культур и эффект, что экспрессиявысоких уровней нужного белка оказывает на миелинизации может быть допрошен. Со-культуры оценивали на экспрессию белка миелина с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализировали для формирования миелиновых аксонов сегментов по иммуногистохимии.