Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore<em> In Vitro</em> Saggi mielinizzazione

Mielinizzazione degli assoni è fondamentale per la trasmissione rapida ed efficiente dei potenziali d'azione sia nel sistema nervoso centrale e periferico. Cellule specializzate, le cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico e oligodendrociti nel sistema nervoso centrale, avvolgono e ensheathe assoni in mielina, efficace isolamento del nervo e facilitando la conduzione saltatory ^1. Il processo di mielinizzazione può essere studiato in vitro utilizzando retina neuroni gangliari ^2, nanofibre ingegnerizzati ^3, o neuroni dei gangli delle radici dorsali co-coltura sia con le cellule di Schwann ⁴ o oligodendrociti ^5-7. Il saggio mielinizzazione in vitro è un modello stabilito per lo studio mielinizzazione del sistema nervoso e si replica molti dei processi fondamentali che avvengono durante la mielinizzazione in vivo ^5-8. Il test prevede la co-coltura di popolazioni purificate di dorsale Root Ganglion (DRG) neuroni, con OPC (per CNS mielinizzazione) o cellule di Schwann (per PNS mielinizzazione). In condizioni particolari queste cellule mielinizzanti ensheathe assoni DRG in ordinata, ultra strutturalmente verificato, scheda multi-lamellare di isolamento membrana plasmatica che esprimono lo stesso complemento di specifiche proteine ​​della mielina presenti in vivo.

Il modello cellulare più comunemente usato di studiare CNS mielinizzazione in vitro è co-colture di neuroni DRG e OPC, che sono stati usati con successo per studiare l'effetto che i fattori esogeni, quali le neurotrofine esercitano sul sistema nervoso centrale mielinizzazione in vitro ^5,6. Fattori esogeni, quali fattori di crescita o piccole molecole inibitori farmacologici sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle vie di segnalazione nella mielinizzazione utilizzando il DRG-OPC modello coculture ^7,9. Tuttavia, nelle impostazioni co-coltura miste contenenti sia i neuroni e oligodendrociti, rimase formalmente possibile che sia i fattori di crescita o il pharinibitori ve- avrebbero potuto esercitare effetti su entrambi i neuroni DRG e oligodendrociti (OL). Questo non offre la possibilità di sezionare specificamente i ruoli che le proteine ​​espresse solo DRG o oligodendroglia esercita su mielinizzazione con questo sistema a doppia cella. Per confermare in modo inequivocabile che il percorso di segnalazione in oligodendrogliale regola direttamente mielinizzazione, trasduzione lentivirale di OPC, prima della semina su neuroni DRG per il saggio mielinizzazione in vitro, ha dimostrato di essere un modo elegante per iperespressione sia wild-type e le proteine ​​mutanti, come pure come espressione atterramento di proteine ​​costitutivamente espresse da oligodendrociti. Così questo approccio offre un viale di interrogare in modo specifico e manipolare vie di segnalazione all'interno oligodendrociti per studiare mielinizzazione ^9,10.

In questo lavoro, si segnala metodi che abbiamo sviluppato per iperespressione una proteina di interesse selettivamente in oligodendrociti mediante lentiviralapproccio per studiare mielinizzazione in vitro. La tecnica inizia con la generazione di vettori di espressione contenenti il ​​gene di interesse, sia esso in un ceppo selvatico, forma negativa costitutivamente attiva o dominante che vengono successivamente clonato nel vettore pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Questo vettore (contenente il gene di interesse), il donatore CMV promotore (pENTR L4-R1-pENTR pDNOR-CMV) e la lentivector 2K7 sono combinati in una reazione enzimatica per produrre un vettore contenente 2K7 CMV promoter, il gene di interesse, un sito interno ribosomiale ingresso e GFP (Figura 1). Questo Gateway clonato costrutto 2K7 combinata con la busta virus PMD2.G e il pacchetto di virus pBR8.91 può essere co-trasfettato in cellule HEK293T generare lentivirus che può essere successivamente utilizzato per trasdurre OPC. Una volta infettati con il lentivirus le OPC esprimono un alto livello della proteina di interesse. Questi OPC possono essere seminati in colture DRG neuroni e l'effetto che l'espressionedi elevati livelli della proteina desiderata esercita sulla mielinizzazione possono essere interrogato. Le co-colture sono valutati per l'espressione delle proteine ​​della mielina mediante analisi western blot e visualizzati per la formazione di segmenti assonale mieliniche mediante immunocitochimica.