ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em> במבחנה</em> מבחני myelination
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
Myelination הוא תהליך מורכב שכרוכים בשני תאי עצב ותאי גליה המיאלין יוצרים, oligodendrocytes במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (PNS). אנו משתמשים במבחנה assay myelination, מודל שנקבע ללימוד myelination CNS במבחנה. כדי לעשות זאת, תאי מבשר oligodendrocyte (OPCs) מתווספים לנוירונים המטוהרים גנגליון שורש הגבי מכרסם העיקרי (DRG) כדי ליצור שיתוף תרבויות myelinating. על מנת לחקור את אופן ספציפי התפקידים שחלבונים מסוימים שהביעו oligodendrocytes מפעילים על myelination פיתחנו פרוטוקולים שסלקטיבי transduce OPCs באמצעות lentivirus ביתר סוג בר, חלבונים שליליים פעילים constitutively או דומיננטיים לפני שזורע על נוירונים DRG. זה מאפשר לנו לחקור את אופן ספציפי את התפקידים של חלבוני oligodendroglial אלה בויסות myelination. יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים במחקר של otסוגי תאיה, ובכך לספק גישה המאפשרת מניפולציה סלקטיבית של חלבונים לידי ביטוי בסוג תא רצוי, כגון oligodendrocytes למחקר הממוקד של איתות ומנגנוני פיצוי. לסיכום, שילוב של assay myelination במבחנה עם OPCs lentiviral נגוע מספק כלי אסטרטגי לניתוח של מנגנונים מולקולריים המעורבים בmyelination.
Introduction
Myelination של אקסונים הוא חיוני להעברה מהירה ויעילה של פוטנציאל פעולה בשתי מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות. תאים מיוחדים, תאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית וoligodendrocytes במערכת העצבים המרכזית, לעטוף וensheathe האקסונים במיאלין, ביעילות בידוד העצב והקלת הולכה קופצנית 1. תהליך היווצרות של מעטפת המיאלין ניתן ללמוד במבחנה באמצעות נוירונים ברשתית גנגליון 2, nanofibers המהונדס 3, או נוירונים גנגליון שורש הגבי שיתוף תרבותי עם שני תאי שוואן 4 או oligodendrocytes 5-7. Assay myelination במבחנה הוא מודל הוקם לחקר myelination מערכת עצבים וזה משכפל רב של התהליכים הבסיסיים המתרחשים במהלך myelination in vivo 5-8. Assay כרוך coculture של אוכלוסיות מטוהרים של הגבי שורש גנגליון (DRG) נוירונים, עם OPCs (לגmyelination NS) או בתאי שוואן (לmyelination PNS). בתנאים מסוימים תאי myelinating אלה ensheathe אקסונים DRG במאומת מבני גיליון הורה, אולטרה, רב-שבשבת של בידוד קרום פלזמה המבטא את אותו משלים של חלבונים ספציפיים המיאלין הנוכחיים in vivo.
מודל התא הנפוץ ביותר של לימוד myelination CNS במבחנה הוא שיתוף התרבויות של נוירונים DRG וOPCs, אשר שימשו בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה שגורמים אקסוגניים כגון neurotrophins להפעיל על myelination CNS במבחנה 5,6. גורמים אקסוגניים כגון גורמי גדילה או מעכבים תרופתיים מולקולה קטן היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את התפקיד של מסלולי איתות בmyelination באמצעות 7,9 מודל coculture DRG-OPC. עם זאת, בהגדרות שיתוף התרבות המעורבות המכילות שני תאי העצב וoligodendrocytes, הוא נשאר באופן רשמי ייתכן שגם גורמי גדילה או pharמעכבי macological יכלו הפעילו השפעות על שני נוירונים DRG וoligodendrocytes (OL). זה עושה מציע את היכולת לנתח באופן ספציפי התפקידים שהחלבונים לידי ביטוי רק על ידי DRGs או oligodendroglia מפעיל על myelination באמצעות מערכת תא הכפולה הזה. כדי לאשר באופן חד משמעי כי מסלול האיתות בoligodendroglial ישירות מסדיר myelination, התמרה lentiviral של OPCs, לפני זריעה על נוירונים DRG לassay myelination במבחנה, הוכיח להיות דרך אלגנטית לביטוי יתר שני wild-type וחלבוני מוטציה, כמו גם כביטוי מציאה של חלבונים הביעו constitutively ידי oligodendrocytes. כך גישה זו מציעה שדרת לחקור באופן ספציפי ולטפל מסלולי איתות תוך oligodendrocytes ללימוד myelination 9,10.
במאמר זה, אנו מדווחים שיטות שפיתחנו לביטוי יתר של חלבון של עניין באופן סלקטיבי בoligodendrocytes באמצעות lentiviralגישה ללימוד myelination במבחנה. הטכניקה מתחילה עם הדור של וקטורי ביטוי המכילים את הגן של עניין, יהיה זה בסוג בר, צורה שלילית פעילה constitutively או דומיננטית אשר לאחר מכן משובטות לאחר מכן לתוך וקטור pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). וקטור זה (המכיל את הגן של עניין), תורם promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) וlentivector 2K7 משולבים בתגובת אנזים לייצר וקטור 2K7 מכיל אמרגן CMV, הגן של עניין, אתר פנימי ריבוזומלי כניסה וGFP (איור 1). מבנה זה Gateway המשובט 2K7 בשילוב עם מעטפת וירוס PMD2.G וחבילת וירוס pBR8.91 יכול להיות שותף transfected לתאי HEK293T ליצור lentivirus שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי transduce OPCs. ברגע שנדבק בlentivirus OPCs להביע רמה גבוהה של החלבון של עניין. אז יכול להיות שנזרע OPCs אלה על תרבויות נוירון DRG ועל ההשפעה שביטוירמות גבוהות של החלבון הרצוי מפעילה על myelination יכול להיחקר. שיתוף התרבויות מוערכות לביטוי חלבון המיאלין על ידי ניתוח כתם מערבי ומדמיינות ליצירת מגזרי axonal myelinated ידי immunocytochemistry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myelination של אקסונים הוא תהליך חיוני לתפקוד האופטימלי של שני מערכות עצבים המרכזיות והיקפיות של בעלי חוליות. הייצור והתחזוקה של אקסונים myelinated הוא תהליך מורכב ומתואם מעורבים אינטראקציות מולקולריות בין תאי עצב, גליה (מתאי שוואן או oligodendrocytes) וחלבוני מטריצה סלולריים נוס…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
- Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
- Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
- Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
- Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
- Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).
