Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour<em> In Vitro</em> Les dosages de la myélinisation

La myélinisation des axones est crucial pour la transmission rapide et efficace des potentiels d'action dans les deux les systèmes nerveux central et périphérique. Des cellules spécialisées, les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique et les oligodendrocytes dans le système nerveux central, se enroulent autour des axones et ensheathe dans la myéline, efficace isolantes du nerf et de faciliter la conduction saltatoire ^1. Le procédé de la myélinisation peut être étudiée in vitro en utilisant des neurones ganglionnaires de la rétine, ² nanofibres par génie ^3, ou neurones ganglionnaires de la racine dorsale co-cultivées avec des cellules de Schwann ou des oligodendrocytes ^{4 7.5.} Le dosage in vitro de la myélinisation est un modèle établi pour l'étude du système nerveux myélinisation et il reproduit la plupart des processus fondamentaux qui se produisent pendant la myélinisation in vivo ^5-8. Le test implique la co-culture des populations purifiées de ganglions de racine dorsale (DRG) neurones, avec OPC (CNS myélinisation) ou des cellules de Schwann (PNS pour la myélinisation). Dans des conditions spécifiques de ces cellules myélinisantes ensheathe axones DRG dans l'ordre, structurellement vérifié, feuille multi-lamellaire ultra de la membrane plasmique qui expriment la même complément de protéines spécifiques de la myéline présents in vivo isolant.

Le modèle de cellule la plus couramment utilisée de l'étude de myélinisation du SNC in vitro est le co-cultures de neurones DRG et OPC, qui ont été utilisés avec succès pour étudier l'effet que des facteurs exogènes tels que les neurotrophines exercent sur ​​myélinisation du SNC in vitro ^5,6. Les facteurs exogènes tels que les facteurs de croissance ou de petites molécules inhibiteurs pharmacologiques ont été largement utilisés pour étudier le rôle des voies de signalisation dans la myélinisation utilisant le DRG-OPC modèle de co-culture ^7,9. Cependant, dans les paramètres de co-culture mixte contenant à la fois des neurones et des oligodendrocytes, il est resté formellement possible que soit les facteurs de croissance ou du pharinhibiteurs macologique auraient exercé des effets à la fois les neurones et les oligodendrocytes (OL) DRG. Cela offre la possibilité de disséquer spécifiquement les rôles que les protéines exprimées uniquement par DRG ou oligodendroglie exerce sur la myélinisation utilisant ce système cellulaire double. Pour confirmer sans équivoque que la voie de signalisation dans oligodendrogliale régule directement la myélinisation, transduction lentiviral des OPC, avant le semis sur les neurones de DRG pour le dosage in vitro de la myélinisation, se est avéré être une manière élégante de surexpression de type sauvage et les protéines mutantes, ainsi comme knockdown expression des protéines exprimées de manière constitutive par les oligodendrocytes. Ainsi, cette approche offre une avenue pour interroger et manipuler spécifiquement les voies de signalisation au sein oligodendrocytes pour étudier la myélinisation ^9,10.

Dans cet article, nous présentons les méthodes que nous avons développées pour surexprimer une protéine d'intérêt dans les oligodendrocytes sélective via un lentivirusapproche pour étudier la myélinisation in vitro. La technique commence avec la génération de vecteurs d'expression contenant le gène d'intérêt, que ce soit dans un type sauvage, forme négative constitutivement active ou dominant qui sont ensuite ensuite clone dans le vecteur pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ce vecteur (contenant le gène d'intérêt), le donneur CMV promoteur (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) et le lentivecteur de 2K7 sont combinés dans une réaction enzymatique pour produire un vecteur de 2K7 contenant le promoteur CMV, le gène d'intérêt, un site interne d'entrée des ribosomes et la GFP (Figure 1). Cette passerelle clone construction d'2K7 combiné avec l'enveloppe du virus PMD2.G et le paquet de virus pBR8.91 peut être co-transfecté dans des cellules HEK293T pour générer lentivirus qui peut ensuite être utilisé pour transduire des OPC. Une fois infectés par le lentivirus les OPC expriment un niveau élevé de la protéine d'intérêt. Ces OPC peuvent ensuite être ensemencées sur les cultures de neurones DRG et l'effet que l'expressionles niveaux des élevés de la protéine désirée exerce sur la myélinisation peut être interrogé. Les co-cultures sont évaluées pour l'expression de la protéine de myéline par analyse Western blot et visualisés pour la formation de segments axonales myélinisées par immunocytochimie.