Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Fabrication 1.Scaffold e sterilizzazione Sciogliere PCL in 1,1,1,3,3,3-esafluoroisopropanolo per dare un 10% w / v concentrazione. Come descritto in Bosworth et al, 9 electrospin soluzione polimerica (parametri: 20 kV, 1 ml / hr, 20 cm). Raccogli fibre allineate sul bordo di un mandrino rotante (600 rpm). Con un bisturi rimuovere il nastro di fibra raccolte e poi tagliate in lunghezze più corte – 3 cm (per le depressioni e le navi rotanti) e 4 cm (per colture cellulari inserti) lunghezze. Utilizzando una pinza sottile immergersi strisce individuali in acqua distillata e rimuovere. Tenendo entrambe le estremità tra il pollice e l'indice; ruotare manualmente il nastro fino a quando non assomiglia thread. Brevemente immergere questo scaffold filiforme in acqua distillata e immissione sul pulito, carta non fibrose asciugare. Una volta asciutto, posto singolarmente in tubi microcentrifuga pulito e aggiungere 1 ml di 50% v / v di etanolo in acqua distillata. Chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. Nota: Effettuare le seguenti operazioni sotto flusso laminare: Inserire provette da microcentrifuga in una cappa a flusso laminare e aspirare il 50% v / v soluzione. Sostituire con 1 ml 70% v / v di etanolo in acqua distillata, chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. Ripetere per 90% e il 100% v / v di etanolo in acqua distillata (1 ml volumi). Lavare ponteggi due volte con tampone fosfato soluzione salina (PBS), 24 hr per lavaggio (2 x 1 ml). Rimuovere PBS e sostituirlo con 1 ml di coltura cellulare multimediale. Nota: Ponteggi sono pronti per l'uso post-24 ore. 2. Determinazione Area Scaffold superficie e numero di celle Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, misurare il diametro del filo elettrofilate lungo la sua lunghezza per determinare un valore medio. Si supponga che il filo ad una barra cilindrica e approssimare la superficie utilizzando: Dove A = Superficie, r = raggio e h = lunghezza Nota: La superficie è stata calcolata essere 18.902, 800 micron 2. Inoltre, va notato che l'area superficiale effettiva sarà maggiore di questo calcolo, il filo è costituito da centinaia di fibre fini, che aumentano la superficie. Di conseguenza un maggior numero di celle deve essere in grado di applicare al ponteggio. Tuttavia, questo non pregiudica un confronto diretto tra i gruppi di prova in corso. Determinare il numero massimo di celle che possono attaccare alla superficie esposta scaffold da: Nota: Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, il diametro di cellule staminali mesenchimali umane è stato determinato in 20 micron (cellule presumendo sono rotondi), quindi in questo caso, il numero di cellule = 60.200. 3. Scaffold Set-up – Colture Cellulari inserti (Figura 1A) Sotto flusso laminare, aprire i 6 e gli inserti di coltura cellulare sterili e separare gli anelli più brevi con i denti dai corpi più ampio inanellati. Prendete l'anello con i denti verso l'alto. Telo unodei quattro centimetri scaffold sul centro del ring assicurandosi che sovrappone su entrambi i lati. Prendere il corpo e la posizione inanellati sopra l'anello dentato e scaffold e spingere verso il basso assicurandosi che il ponteggio rimane in posizione e passa attraverso il centro dell'inserto di coltura cellulare. Collocare l'inserto coltura cellulare con scaffold nel pozzo di una ben 6, basso piatto vincolante. Aggiungere 10 ml di coltura al patibolo. 4. Scaffold Set-up – Trough (Figura 1B) Sotto flusso laminare, posto poli (tetrafluoroetilene) (PTFE) abbeveratoi in singole piastre di Petri e aggiungere 10 ml di terreni di coltura per la depressione. Utilizzando pinze coprono una delle tre centimetri scaffold nel trogolo, assicurandosi che la sua lunghezza è parallelo al bordo più lungo del trogolo. 5. Scaffold Set-up – bioreattore Vessel (Figura 1C) Sotto flusso laminare, a meno di 10 ml di PBS sterile attraverso il bioreattore nave delporto principale e lasciare per 10 min. Rimuovere la PBS e sostituirlo con 8 ml di coltura. Utilizzando pinze, inserire uno dei ponteggi tre centimetri nel vaso attraverso la porta principale. Chiudete la porta principale. 6. Conteggio delle cellule Le cellule staminali mesenchimali umane Cultura (hMSC) derivate dal midollo osseo in base al protocollo fabbricante, fino al passaggio 4 prima della raccolta. Aspirare il supporto da 75 cm 2 pallone contenente hMSCs derivate dal midollo osseo (passaggio 4, 80% confluenza). Lavare le cellule con 10 ml di PBS sterile e aspirare. Aggiungere 3 ml di tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C, 5% CO 2 finché le cellule hanno staccato dalla superficie matraccio. Aggiungere 7 ml terreni di coltura per inattivare l'enzima e trasferire questo volume totale (10 ml) in una provetta per centrifuga. Risospendere la sospensione cellulare pipettando su e giù parecchie volte per disperdere in modo omogeneo le cellule all'interno dellamedia e agglomerati di cellule limite (10 ml pipetta). Rimuovere 20 ml di sospensione cellulare e trasferimento in un emocitometro. Posizionare il emocitometro sotto un microscopio ottico e immagine a scopo x10. Concentrarsi le griglie e contare il numero di cellule nei 4 x 4 quadrati in ogni angolo della rete e che rientra nell'ambito di piazza e quelli che attraversano la mano destra o la linea di confine di fondo. Contare per ogni set di 4 x 4 quadrati (4 conteggi per griglia). Ripetere il numero di risospensione e la cella per tre volte (passi 6,6-6,9). Calcolare il numero medio di cellule e determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione delle cellule (concentrazione cellulare 60.200 in 200 ml). Ad esempio, determinare il numero di celle media dal emocitometro e quindi determinare il numero medio complessivo di cellule dai tre conteggi separati. Moltiplicare questo 1 x 10 4 invia il numero di cellule per ml e poi moltiplicare per il volume totale della sospensione cellulare per darenumero Tal di cellule. Utilizzare la seguente equazione per determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione: Centrifugare la sospensione cellulare a 241 xg per 5 min. Seeding 7. cellulare Aspirare il supporto dal tubo centrifugato lasciando il pellet e sostituire con il volume del supporto calcolato. Risospendere le cellule e dei media per una miscela omogenea. Usando una pipetta P200 Gilson, lentamente erogare 200 ml di sospensione cellulare su ogni scaffold eseguendo la punta della pipetta lungo la lunghezza scaffold e sotto la superficie del supporto liquido. Lasciare riposare per 20 minuti. Per le navi bioreattori, erogare 200 ml di sospensione cellulare attraverso la porta principale. Top-up il rimanente mezzo di coltura 2 ml tramite le porte siringa per dare un volume totale di 10 ml. 8. Avvio sperimentale Trasferire i vasi bioreattore al bioreattore RCC-4DQ e impostare la rotazione a 9 giri. TranSFER le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi alla piastra shaker e impostare la rotazione a 30 giri al minuto. Trasferire le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi per il ripiano di un incubatore di cellule a 37 ° C, 5% CO 2 (cultura statica). 9. DNA Assay Preparare le soluzioni tampone – lisi, tampone 1x TE, standard di DNA e di soluzioni di lavoro del DNA delle cellule – come da istruzioni del produttore. Dopo 4 ore, togliere i campioni dal termostato e mettere sotto flusso laminare. Rimuovere le frazioni multimediali da tutti i campioni e metterli in provette etichettati separatamente. Centrifugare le provette 241 xg. Rimuovere il surnatante e aggiungere tampone di lisi 3 ml. Risospendere la soluzione a rottura, il pellet di cellule. Utilizzando pinze rimuovere i ponteggi e posto in provette contenenti 3 ml di tampone di lisi (per i ponteggi all'interno dei vasi bioreattori, rimuovere l'impalcatura prima aspirazione del media). Per ponteggi condotte nell'ambito inserti di coltura cellulare, prima liberare l'impalcatura tagliando il ponteggio vicino al bordo dell'inserto con un bisturi. Aggiungere 3 ml di tampone di lisi per ogni recipiente scaffold e raschiare la superficie (agitare energicamente per i vasi bioreattori). Rimuovere il tampone di lisi e mettere in provette etichettati separatamente. Vortex ogni provetta da centrifuga per circa 1 min per garantire sufficiente agitazione delle cellule e bufferizzare e incoraggiare lisi della membrana cellulare. In un nero 96 pozzetti, aggiungere 100 ml di tampone di lisi per ogni frazione del campione – impalcatura, media e ben (duplicare). Nel buio, aggiungere 100 ml di soluzione di DNA delle cellule di tutti i pozzetti contenenti tampone di lisi e mescolare delicatamente. Include pozzetti con tampone di lisi contenente nessun DNA e DNA cellulare soluzione per fornire un controllo negativo e positivo per la piastra bene. Utilizzando una fluorescenza piatto-reader, l'estinzione del pozzos utilizzando 485 nm di eccitazione e 520 nm di emissione. Confrontare i dati con la curva standard generata dagli standard del DNA come da istruzioni del produttore. 10. Microscopio elettronico a scansione (SEM) Fixation Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di flusso laminare: Dopo 4 ore, rimuovere tutti i ponteggi dai loro recipienti e posto all'interno di un nuovo 6-pozzetti (pozzetti separati). Lavare i ponteggi due volte con PBS. Effettuare le seguenti operazioni sul banco aperto: per ogni bene, aggiungere 2 ml di 1,5% v / v glutaraldeide in PBS per garantire una copertura completa del patibolo. Lasciare la piastra per almeno 30 minuti a 4 ° C per il fissaggio delle cellule. Rimuovere la soluzione fissativo e lavare i ponteggi due volte con PBS. Disidratare i ponteggi con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua distillata partendo da 50% v / v, seguito dal 70% v / v e 90% v / v. Per ogni concentrazione, immergere completamente i ponteggi in solution (2 ml) e lasciare per 3 min. Scartare la soluzione e ripetere. Disidratare in 100% etanolo submersing pienamente scaffold in soluzione (2 ml) e lasciando per 5 min. Scartare la soluzione e ripetere. Chimicamente asciugare i ponteggi con esametildisilazano (HMDS) all'interno di una cappa. Immergere i ponteggi in HMDS (2 ml) e lasciare per 5 min. Rimuovere le HMDS e ripetere. Rimuovere le HMDS e permettere ai ponteggi asciugare. Montare i ponteggi su disponibili in commercio stub SEM (in questo caso mozziconi in acciaio inox con alette in carbonio adesive). Per facilitare la visualizzazione all'interno del SEM, cappotto i campioni utilizzando una verniciatura gold-polverizzazione per 2 minuti per assicurare una copertura sottile e uniforme. I campioni all'interno del SEM e visualizzare i ponteggi cellulari testa di serie con un fascio di elettroni 5 keV.