Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи

1.Scaffold Изготовление и стерилизации Растворите PCL в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле, чтобы дать 10% W / концентрацию V. Как описано в Босворте др 9 electrospin полимерного раствора (параметры: 20 кВ, 1 мл / ч, 20 см). Выровнены и собирать волокон на краю вращающегося дорна (600 оборотов в минуту). С помощью скальпеля удалить ленту собранного волокна, а затем разрезать на более короткие отрезки – 3 см (для прогибов и ротационных судов), и 4 см (для культивирования клеток вставки) длины. Использование тонких щипцов погрузиться отдельные полосы в дистиллированной воде и удалить. Проведение оба конца между большим и указательным пальцами; вручную крутить полосу, пока это не напоминает резьбу. Кратко погрузиться эту тему, как эшафот в дистиллированной воде и поместите на чистую, неволокнистого карты, чтобы высохнуть. После высыхания, место отдельно в чистом микроцентрифужных пробирках и добавить 1 мл 50% объем / объем этаноле в дистиллированной воде. Закройте крышки и оставьте на 24 ч. Примечание: Выполните следующие действия в соответствии ламинарного потока: Поместите микроцентрифужных пробирок в шкафу с ламинарным потоком и аспирации 50% раствор об / об. Замените 1 мл 70% об / об этанола в дистиллированной воде, закройте крышками и оставьте на 24 часов. Повторите 90% и 100% об / об этанола в дистиллированной воде (1 мл объемы). Промыть каркасов в два раза фосфатным буферным солевым раствором (PBS), 24 часа в сутки на промывку (2 × 1 мл). Удалить PBS и заменить среды для культивирования клеток 1 мл. Примечание: Строительные леса будут готовы к использованию после 24 часов. 2. Определение Леса площадь поверхности и число клеток С помощью светового микроскопа и обработки изображений, измерить диаметр electrospun нити вдоль ее длины, чтобы определить среднее значение. Предположим, что нить цилиндрический стержень и аппроксимировать поверхность с помощью: Где = Площадь, г = радиус и ч = длина Примечание: площадь поверхности была рассчитана на 18 902800 мкм 2. Кроме того, следует отметить, что фактическая площадь поверхности будет больше, чем в этом расчете нить состоит из сотен тонких волокон, что позволит увеличить площадь поверхности. Следовательно большее количество клеток должно быть в состоянии приложить на эшафот. Тем не менее, это не влияет на прямое сравнение между тестовыми группами делается. Определите максимальное количество ячеек, которые могут прикрепляться к открытой поверхности лесов по: Примечание: с помощью светового микроскопа и обработки изображений, диаметр мезенхимальных стволовых клеток человека было установлено, что 20 мкм (при условии, клетки круглые), поэтому в данном случае, число клеток = 60200. 3. Леса Set-до – Культура клеток Вставки (1А) Под ламинарного потока, откройте стерильные культуры клеток, вставки 6-а и отделить короткие кольца с зубами от широкого кольчатых органов. Возьмите кольцо с зубами вверх. Накройте одинКМ лесов 4 на центр кольца, убедившись, что он перекрывает с обеих сторон. Возьмем кольцами тела и положение над зубчатым кольцом и строительные леса и нажать вниз убедившись, что каркас находится в положении, и проходит через центр клеточной культуры вставки. Поместите клеточной культуры вставку с помоста в лунку 6-луночного, низкой связывающей пластине. Добавить 10 мл культуральной среды на эшафот. 4. Леса Настройка – желоб (рис 1B) Под ламинарного потока, место поли (тетрафторэтилена) (PTFE) желоба в отдельных чашках Петри и добавить 10 мл культуральной среды в желобе. Использование щипцов драпировать один из 3 см лесов в корыто, убедившись, что его длина лежит параллельно длинной стороны желоба в. 5. Леса Настройка – биореактора (рис 1C) Под ламинарного потока, обойтись 10 мл стерильной PBS через биореактор судовыхГлавный порт и оставить на 10 мин. Снимите PBS и заменить 8 мл культуральной среды. Использование щипцов, вставить один из см лесов 3 в сосуд через основной порт. Закройте главный порт. 6. Cell Counting Культура человека мезенхимальные стволовые клетки (hMSC), полученных из костного мозга в зависимости производитель протокола до прохода 4 до уборки урожая. Аспирируйте средств массовой информации из 75 см 2 колбу, содержащую hMSCs, полученные из костного мозга (проход 4, 80% слияния). Вымойте клеток с 10 мл стерильного PBS и аспирации. Добавить 3 мл трипсина и инкубируют в колбе при 37 ° С, 5% СО 2 до тех пор, пока клетки не были смещены от поверхности колбы. Добавить 7 мл питательных сред для инактивации фермента и перенести этот общий объем (10 мл) в центрифужную пробирку. Ресуспендируют этой клеточной суспензии с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы равномерно рассеять клеток вСМИ и ограничение клеток агломераты (10 мл пипетки). Удалить 20 мкл суспензии и передачи клеток в гемоцитометра. Поместите гемоцитометр под световым микроскопом и изображения на x10 цели. Фокус сетки и подсчитывается количество ячеек в 4 х 4 квадратов в каждом углу сетки и которые подпадают площади, и те, которые пересекают правую руку или нижнюю границу. Граф для каждого набора 4 х 4 квадратов (4 числа на сетке). Повторите Ресуспендирование и число элементов в три раза (шаги 6.6-6.9). Рассчитайте среднее число клеток и определения объема средств массовой информации, необходимых для клеток ресуспендирования (концентрация клеток 60200 в 200 мкл). Например, определить среднее количество клеток с гемоцитометра а затем определить общую среднее число клеток из трех отдельных импульсов. Умножьте это на 1 х 10 4, чтобы дать число клеток в мл, а затем умножить на общий объем клеточной суспензии чтобы отдатьTal количество клеток. Используйте следующую формулу для определения объема средств массовой информации, необходимых для взмучивания: Центрифуга клеточной суспензии в 241 мкг в течение 5 мин. 7. посева клеток Аспирируйте носитель из центрифугирования трубы оставляя осадок клеток и заменить с расчетного объема средств массовой информации. Ресуспендируют клетки и средств массовой информации для смешивать. С помощью пипетки Gilson P200, медленно обойтись 200 мкл клеточной суспензии на каждый помост, выполнив кончик пипетки по длине лесов и ниже поверхности жидкости массовой информации. Оставьте в покое в течение 20 мин. Для биореактора судов, обойтись 200 мкл клеточной суспензии через основной порт. Пополнение остальные культуральные среды 2 мл с помощью шприца портов, чтобы дать общий объем 10 мл. 8. Экспериментальная Начало Трансфер в биореактор суда в биореактор RCCS-4DQ и установить, чтобы повернуть на 9 оборотов в минуту. TranSFER хорошо пластины с клеточной культуры вставками и впадинами в шейкере, пластины и установить, чтобы повернуть на 30 оборотов в минуту. Передача также таблички с клеточной культуры вставками и впадинами на шельфе мобильный инкубатор при 37 ° С, 5% CO 2 (статическая культура). 9. Анализ ДНК Готовят растворы – лизис буфера, 1x TE буфера, стандарты ДНК и рабочего раствора ДНК клеток – в соответствии с инструкциями производителя. После 4 ч, удалить образцы из инкубатора и помещают под ламинарном потоке. Удалить медиа фракции из всех образцов и поместите в отдельно помечены центрифужные пробирки. Центрифуга трубок 241 XG. Удалить супернатант и добавить 3 мл буфера для лизиса. Ресуспендируют решение ломка осадок клеток. Использование щипцов удалить каркасов и место в центрифужные пробирки, содержащие 3 мл буфера для лизиса (для строительных лесов в биореакторе сосудов, снять на эшафот до аспирации меняАСВ). Для лесов, проводимых в рамках культуры клеток вставками, сначала освободить эшафот за счет сокращения на эшафот близко к краю вставки, используя скальпель. Добавить 3 мл буфера для лизиса каждому лесов емкость и царапать поверхность (энергично агитировать за биореакторные сосудов). Снимите буфер для лизиса и поместить в отдельно помечены центрифужные пробирки. Вихревой друг центрифужную пробирку в течение приблизительно 1 мин, чтобы обеспечить достаточное перемешивание клеток и буфера и стимулировать лизис клеточной мембраны. В черном 96-луночного планшета, добавить 100 мкл буфера для лизиса для каждого образца фракции – строительные леса, СМИ и хорошо (дубликат). В темноте, добавить 100 мкл раствора ДНК клеток во все лунки, содержащие буфер для лизиса и аккуратно перемешать. Включить скважин с буфером для лизиса, не содержащей ДНК и ДНК клеток решение для обеспечения отрицательного и положительного контроля для пластины также. Использование флуоресценции пластины-ридер, измеряют поглощение скважиныс с помощью 485 нм возбуждение и 520 нм эмиссия. Сравните данные со стандартной кривой, полученной из ДНК-стандартами, как в соответствии с инструкциями производителя. 10. Сканирующий электронный микроскоп (SEM) Фиксация Выполните следующие действия в соответствии с ламинарного потока: После 4 часов, удалите все каркасы из своих сосудов и место в новой 6-луночного планшета (отдельные скважины). Вымойте каркасов дважды PBS. Выполните следующие действия на открытом скамейке: В каждую лунку добавляют 2 мл 1,5% об / об глутаральдегида в PBS, чтобы обеспечить полный охват эшафот. Оставьте пластину для минимального 30 мин при 4 ° С для фиксации клеток. Снимите фиксирующий раствор и промойте каркасов дважды PBS. Обезвоживают каркасов с возрастающими концентрациями этанола в дистиллированной воде, начиная с 50% об / об, с последующим 70% об / об и 90% об / об. Для каждой концентрации, полностью погрузите строительные леса SOLUTION (2 мл) и оставить на 3 мин. Отменить решение и повторить. Высушить в 100% -ном этаноле, полностью погружением каркасов в растворе (2 мл) и оставить на 5 мин. Отменить решение и повторить. Химически сухой строительные леса, используя гексаметилдисилазана (HMDS) в вытяжном шкафу. Погрузитесь строительные леса HMDS (2 мл) и оставить на 5 мин. Снимите HMDS и повторите. Снимите HMDS и позволяют каркасы для просушки. Установите каркасов на коммерчески доступных SEM ответвлений (в данном случае из нержавеющей стали штыри с клеем углерода вкладок). Чтобы облегчить просмотр в SEM, пальто образцы с использованием золота дл покрыти распылением в течение 2 мин, чтобы обеспечить тонкую и равномерное покрытие. Образцы место в РЭМ и визуализировать клеточные семенами каркасов помощью электронно-лучевой 5 кэВ.