ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

1.Scaffold作製と滅菌 10％のw / vの濃度を得1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノールでPCLを溶解する。 。ポリマー溶液（パラメータ：20 kVの、1ミリリットル/時、20cm）にエレクトロスピニングボスワースら 、9で説明したように、回転するマンドレル（600回転）の端に繊維を整列収集します。メスで収集された繊維のリボンを削除してから、短い長さに切断 – （細胞培養インサート用）（谷と回転船舶用）3センチメートルと4センチメートル長さ。 細かい鉗子を使用すると、蒸留水に個々のストリップを水没して削除する。 親指と人​​差し指の間の両端を保持する。それは、スレッドに似ているまで、手動でストリップをねじる。 簡単に説明すると乾燥するために、クリーン、非繊維状カードに蒸留水と所定の位置に、このスレッドのような足場を沈める。 きれいな微量遠心チューブ中で個別に乾燥したら、場所、蒸留水中50％v / vのエタノールの1ミリリットルを追加します。蓋を閉じて、2に向けて出発4時間。 注：層流の下で次の手順を実行します。 クリーンベンチでマイクロチューブを配置し、50％のV / v溶液を吸引。 1ミリリットルの蒸留水中70％v / vのエタノール、近くに蓋を交換し、24時間に向けて出発。 90％を繰り返し、蒸留水100％（v / v）のエタノール（1ミリリットル容量）。 洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、洗浄あたり24時間（2×1ml）で二回足場。 PBSを除去し、1ミリリットル細胞培養培地と交換してください。注：足場は、使用後の24の時間の準備ができている。 2。足場の表面積と細胞数を測定光学顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、平均値を決定するために、その長さに沿って電界紡糸ヤーンの直径を測定する。 円筒状のロッドであることが糸を想定し、使用して表面積を近似する。 A =表面積あり、r =半径であり、h =長さ注：表面積が18902と計算された、800μmの2。さらに、糸は、表面積を増加させる微細繊維、数百から構成されているように、実際の表面積が、この計算よりも大きくなることに留意すべきである。その結果、細胞の数が多いほど、足場に取り付けることができるはずです。しかし、これは行われた試験群間の直接比較に影響を与えない。 によって公開さ足場表面に付着できたセルの最大数を決定します。 注：光学顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、ヒト間葉系幹細胞の直径が20μmであると決定された（細胞が丸くと仮定して）、細胞= 60200のため、この場合には、数。 3.足場セットアップ – セルカルチャーインサート（図1A） 層流下、無菌の6ウェル細胞培養インサートを開いて、より広い環状体から歯に短いリングを分離する。 上向き歯とリングを取る。ドレープ1確認は、両側に重なる作るリングの中心上に4cmの足場。歯付きリングと、足場の上に環状体と位置を取り、足場位置に留まり、細胞培養インサートの中心を通ってある確認して下方に押し込む。 6ウェル、低結合プレートのウェルに足場を持つ細胞培養インサートを置きます。 足場に培養培地の10ミリリットルを追加します。 4.足場セットアップ – トラフ（図1B） 層流の下では、場所のポリ（テトラフルオロエチレン）（PTFE）は、個々のペトリ皿に谷と谷に培養培地の10ミリリットルを追加します。 鉗子を使用すると、必ず、その長さは、トラフの長辺に平行に位置作るトラフに3cmの足場のいずれかをドレープ。 5.足場セットアップ – バイオリアクター容器（図1C） 層流の下で、バイオリアクター容器のを通して滅菌PBSを10ml分配メインポートと10分間のまま。 PBSを除去し、8ミリリットル培養培地と交換してください。 鉗子を使用して、メインポートを介して容器に3cmの足場の1を挿入します。 メインポートを閉じる。 6.細胞の計数最大収穫前の通路4に、製造業者のプロトコルに従って、骨髄由来の培養ヒト間葉系幹細胞（hMSCを）。 骨髄（通路4、80％のコンフルエンシー）に由来したhMSCを含む75cm 2のフラスコから培地を吸引除去する。 10ミリリットル滅菌PBSと吸引で細胞を洗浄。 3ミリリットルのトリプシンを添加し、細胞がフラスコ表面から除去されるまで、37℃、5％CO 2でフラスコをインキュベートする。 酵素を不活性化し、遠心チューブにこの総容量（10ml）に転送するために7ミリリットルの培地を加える。 均質内の細胞を分散させるために数回上下にピペッティングすることにより、この細胞懸濁液を再懸濁メディアリミット細胞凝集体（10 mlピペットを用いて、）。 細胞懸濁液の20μlのを削除し、血球計数器に転送。 X10の目的で、光学顕微鏡と画像の下に血球計数器を配置します。 グリッド線を集中し、グリッドの各隅に4×4の正方形のセルの数をカウントし、その正方形、右手または下部境界線と交差しているものに含まれる。 4×4の正方形（グリッドあたり4カウント）のセットごとにカウントします。 再懸濁し、細胞数を3回（6.6から6.9ステップ）繰り返します。 平均細胞数を計算し、細胞の再懸濁（200μl中の細胞濃度60200）に必要なメディアの量を決定する。例えば、血球計数器からの平均細胞数を決定した後、3つの別々のカウントからの細胞の全体的な平均数を決定する。 1ml当たりの細胞数を与え、その後に与える細胞懸濁液の全体積を掛けるために、1×10 4によって、これを掛ける細胞のTAL番号。再懸濁のために必要なメディアの容量を決定するために、次の式を使用します。 5分間、241×gで細胞懸濁液を遠心。 7.細胞播種細胞ペレットを残して遠心分離チューブから培地を吸引除去し、計算されたメディアボリュームと交換します。 でも混ぜるための細胞および培地を懸濁します。 P200ギルソンピペットを使用して、ゆっくりと足場の長さに沿って媒体の液面下にピペットの先端を実行することによって、各足場上の細胞懸濁液200μlを分注する。 20分間邪魔されずにしておきます。 バイオリアクター容器の場合は、メインポートを介して細胞懸濁液200μlを分注する。注射器ポートを介してトップアップ残りの2mlの培地を、10mlの全容積を得た。 8.実験スタート RCCS-4DQバイオリアクターに、バイオリアクター容器を移し、9 rpmで回転するように設定。 トランシェーカープレートに細胞培養インサートおよび谷を有するウェルプレートをsferおよび30rpmで回転するように設定。 37℃、5％CO 2（静置培養）に設定細胞インキュベーターの棚に細胞培養インサートおよび谷を有するウェルプレートに移す。 9. DNAアッセイ溶解バッファー、1×TEバッファー、DNA標準と細胞DNAの作業溶液 – – 製造業者の指示に従って溶液を調製する。 4時間後、インキュベーターからサンプルを除去し、層流の下に置く。 別途ラベル遠心管の全サンプルと場所からメディア画分を削除します。チューブ241 XGを遠心。上清を除去し、3ミリリットルの溶解バッファーを追加します。ブレークアップするために細胞ペレットをソリューションを懸濁します。 鉗子は3ミリリットルの溶解緩衝液を含む遠心管における足場と場所を削除]を使用して（バイオリアクター血管内足場のために、前に私を吸引する足場を削除DIA）。細胞培養インサート内に保持された足場のために、最初のメスを用いて、挿入物の端部の近くに足場を切断して足場を解放する。 各足場コンセントに溶解バッファーの3ミリリットルを追加し、表面をこすり（精力的にバイオリアクター船舶の攪拌）。溶解バッファーを外し、別途ラベル遠心管を内の場所。 ボルテックスを約1分間、各遠心管細胞の十分な攪拌を確保し、バッファリングし、細胞膜の溶解を促進するため。 足場、メディアとうまく（複製） – 黒の96ウェルプレートでは、各サンプル画分についての溶解バッファー100μlを添加する。 暗闇の中で、溶解緩衝液を含む全てのウェルに、細胞DNA溶液100μlを追加し、穏やかに混合する。 ウェルプレートのための陰性および陽性対照を提供することなくDNAおよび細胞DNA溶液を含まない溶解緩衝液でウェルを含む。 蛍光プレートリーダーを使用して、ウェルの吸光度を測定する485nm励起および520nmの発光を用いだ。 メーカーの説明書に従ってDNA標準から生成された標準曲線とのデータを比較してください。 10.走査型電子顕微鏡（SEM）固定層流の下で次の手順を実行します。4時間後、新たな6ウェルプレート内でのレセプタクルと場所（別々のウェル）からすべての足場を削除する。 PBSで2回足場を洗ってください。 各ウェルに、足場の完全なカバレッジを確保するために、PBS中の1.5％（v / v）のグルタルアルデヒドの2ミリリットルを追加します。オープンベンチで次の手順を実行します。 細胞固定のために、4℃で、最低30分間​​プレートのままにしておきます。 固定液を除去し、PBSで2回足場を洗う。 70％v / vの90％v / vで、続いて、50％v / vで始まる蒸留水にエタノールの濃度を増加させて足場を脱水する。各濃度について、完全にsolutioで足場を沈めるN（2ミリリットル）と3分間のまま。液を捨て、繰り返します。 完全に溶液中で足場（2ml）中に浸すと、5分間放置することにより、100％エタノールで脱水する。液を捨て、繰り返します。 化学的にヒュームフード内でヘキサメチルジシラザン（HMDS）を使用して足場を乾燥させてください。 HMDSで足場（2ミリリットル）を浸し、5分間のまま。 HMDSを取り外して、繰り返します。 HMDSを削除し、足場を乾燥させる。 （この場合は接着剤のカーボンタブを持つステンレス鋼のスタブで）市販のSEMスタブ上に足場をマウントします。 SEM内に表示容易にするために、2分間の金スパッタコーターを使用してコート試料は、薄くて均一な被覆を確実にする。 場所のSEM内のサンプルと5ドーズの電子ビームを用いて、細胞播種足場を視覚化する。