אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

ייצור ועיקור 1.Scaffold לפזר PCL ב1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol לתת 10% w / v ריכוז. כפי שתואר בוסוורת 'ואח', 9 electrospin פתרון פולימרים (הפרמטרים: 20 kV, 1 מיליליטר / שעה, 20 סנטימטרים). ולאסוף מיושר סיבים על קצה mandrel מסתובב (600 סל"ד). עם אזמל להסיר את הסרט של סיבים שנאספו ואז לחתוך לאורכים קצרים יותר – 3 סנטימטר (לשקתות וכלי סיבוביים) ו- 4 סנטימטר (לתרבית תאים מוסיף) אורכים. בעזרת מלקחיים קנס להטביע רצועות בודדות במים מזוקקים ולהסיר. מחזיק שני הקצוות בין האגודל לאצבע; לסובב ידני את הרצועה עד שדומה חוט. בקצרה לצלול הפיגום דמוי חוט הזה במים מזוקקים ומניח על אי-סיבי כרטיס נקי, לייבוש. ברגע שיבש מקום, בנפרד בצינורות microcentrifuge נקיים ולהוסיף 1 מיליליטר של 50% אתנול v / v במים מזוקקים. סגור את המכסים ולהשאיר למשך 24 שעות. הערה: בצע את השלבים תחת זרימה למינרית הבאה: מניחים צינורות microcentrifuge בזרימה למינרית ולשאוב את פתרון v / v 50%. החלף עם 1 מיליליטר אתנול 70% v / v במים מזוקקים, קרובים מכסים ומשאירים למשך 24 שעות. חזור על פעולה עבור 90% ו 100% אתנול v / v במים מזוקקים (1 מיליליטר כרכים). לשטוף פיגומי פעמיים עם תמיסת מלח פוספט (PBS), 24 שעות לכל לשטוף (2 x 1 מיליליטר). הסר PBS ולהחליף עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. הערה: פיגומים מוכנים לשעת שימוש לאחר 24. 2. קביעת שטח פן פיגום ומספר התאים באמצעות תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ ואור, למדוד את הקוטר של חוט electrospun לאורכו כדי לקבוע ערך ממוצע. תניח חוט להיות מוט גלילי ולהתקרב לשטח פנים באמצעות: איפה פני שטח =, r = רדיוס וh = אורך הערה: השטח היה מחושב להיות 18902, 800 מיקרומטר 2. יתר על כן, יש לציין כי השטח בפועל יהיה גדול יותר מחישוב זה כחוט מורכב ממאות סיבים עדינים, אשר יגדילו את שטח הפנים. כתוצאה מכך מספר גדול יותר של תאים צריך להיות מסוגל לצרף אל הגרדום. עם זאת, זה לא משפיע על השוואה ישירה בין קבוצות בדיקה שנעשית. לקבוע את המספר המרבי של תאים שיכולים לצרף אל פני השטח הפיגום נחשף על ידי: הערה: שימוש בתוכנת מיקרוסקופ והדמיה אור, הקוטר של תאי גזע mesenchymal האדם היה נחוש להיות 20 מיקרומטר (תאי הנחה הם עגולים), ולכן במקרה זה, מספר התאים = 60200. 3. פיגום Set-up – Cell תרבות תוספות (איור 1 א) תחת הזרימה למינרית, לפתוח את התרבות מוסיף תא 6-גם סטרילי ולהפריד את הטבעות קצרות עם שיניים מהגופים רחבות מוקפים. קח את הטבעת עם שיניים מצביעות כלפי מעלה. לעטוף אחדשל פיגומי 4 סנטימטרים מעל מרכז הטבעת לוודא שזה חופף בשני הצדדים. קח את הגוף ועמדה מוקפים על טבעת השיניים ופיגום ולדחוף כלפי מטה כדי לוודא שהפיגום נשאר בעמדה והשקרים דרך המרכז של להכניס את תרבית תאים. במקום להכניס תרבית תאים עם פיגום לתוך הבאר של היטב 6, צלחת מחייבת נמוכה. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לפיגום. 4. פיגום Set-up – שוקת (איור 1) תחת הזרימה למינרית, פולי המקום (tetrafluoroethylene) (PTFE) שקתות לצלחות פטרי אישיות ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לשוקת. בעזרת מלקחיים לעטוף אחד 3 פיגומי סנטימטרים לתוך השוקת, כדי לוודא שאורכו נמצא במקביל לקצה הארוך של השוקת. 5. פיגום Set-up – כלי Bioreactor (איור 1 ג) תחת הזרימה למינרית, להפריש 10 מיליליטר PBS סטרילי באמצעות כלי של bioreactorנמל ועיקרי להשאיר למשך 10 דקות. הסר את PBS ולהחליף עם תקשורת והתרבות 8 מיליליטר. בעזרת מלקחיים, להכניס אחד מפיגומי 3 סנטימטר לתוך הכלי דרך היציאה הראשית. סגור את הנמל הראשי. ספירת 6. Cell תאי תרבות אנושיים גזע mesenchymal (hMSC) נגזרים ממח עצם על פי פרוטוקול עד למעבר 4 לפני קציר יצרן. לשאוב את התקשורת מסנטימטר 75 2 בקבוק המכיל hMSCs נגזר ממח עצם (קטע 4, confluency 80%). לשטוף את התאים עם PBS ולשאוב 10 מיליליטר סטרילי. הוסף 3 מיליליטר טריפסין ודגירת הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים וחילצה ממשטח הבקבוק. להוסיף 7 מיליליטר תקשורת ותרבות כדי להשבית את האנזים ולהעביר נפח זה כולל (10 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות. Resuspend השעיה תא זה על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר הומוגנית תאים בתוךתקשורת וagglomerates תא גבול (10 פיפטה מיליליטר). הסר 20 μl של השעיה תא והעברה לhaemocytometer. הנח את haemocytometer תחת מיקרוסקופ אור ותמונה במטרת x10. פוקוס קווי הרשת ולספור את מספר התאים ב4 x 4 ריבועים בכל פינה של הרשת ואשר נופלים בתוך הריבוע ואלה החוצים את יד ימין או קו גבול תחתון. רוזן לכל סט של 4 x 4 ריבועים (4 סעיפים לרשת). חזור על ספירת resuspension ותא שלוש פעמים (שלבים 6.6-6.9). לחשב את ספירת תאים הממוצעת ולקבוע את עוצמת הקול של מדיה הנדרשת לresuspension תא (תא ריכוז 60200 ב -200 μl). לדוגמא, לקבוע את ספירת תאים הממוצעת מhaemocytometer ולאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע הכולל של תאים משלושה סעיפים נפרדים. תכפיל את זה ב 1 x 10 4 לתת מספר התאים למ"ל, ואז להכפיל בנפח הכולל של השעיה תא לתת למספר הטל של תאים. השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע נפח של תקשורת הנדרשת לresuspension: צנטריפוגה ההשעיה התא ב241 XG במשך 5 דקות. זריעת 7. Cell לשאוב את התקשורת מצינור centrifuged עוזב את התא גלולה ולהחליף עם מחושב נפח התקשורת. Resuspend התאים והתקשורת אפילו לערבב. בעזרת פיפטה Gilson P200, לוותר לאט 200 μl של השעיה תא על כל פיגום על ידי הפעלת קצה פיפטה לאורך הפיגום ומתחת לפני השטח הנוזלי תקשורת. השאר באין מפריע במשך 20 דקות. לכלי bioreactor, לוותר 200 μl של השעיה תא דרך היציאה הראשית. Top-עד התקשורת נותרה 2 מיליליטר התרבות דרך יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. 8. ניסויי התחל העבר את כלי bioreactor לbioreactor RCCS-4DQ ולהגדיר כדי לסובב בשעה 9 בסל"ד. טראןספיר הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות לצלחת שייקר ולהגדיר כדי לסובב ב 30 סל"ד. העבר את הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות למדף של חממת תא נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (תרבות סטטית). 9. DNA Assay הכן פתרונות – מאגר תמוגה, מאגר 1x TE, תקני ה- DNA ופתרון עובד DNA תא – בהתאם להנחיות היצרן. לאחר 4 שעות, להסיר את הדגימות מהחממה ולמקם תחת הזרימה למינרית. הסר את השברים תקשורת מכל המדגמים ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. צנטריפוגה הצינורות 241 XG. הסר את supernatant ולהוסיף למאגר תמוגה 3 מיליליטר. Resuspend הפתרון להתפרקות התא גלולה. בעזרת מלקחיים להסיר את הפיגומים ומקום בצינורות צנטריפוגה המכילים 3 מיליליטר חיץ תמוגה (לפיגומים בתוך כלי bioreactor, להסיר את הפיגום לפני aspiratingקוטר). לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא, לשחרר ראשון פיגום על ידי חיתוך הפיגום בסמוך לשפת של insert באמצעות אזמל. הוסף 3 מיליליטר של חיץ תמוגה לכל כלי קיבול פיגום ולגרד את פני השטח (במרץ להתסיס לכלי bioreactor). הסר את מאגר תמוגה ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. מערבולת כל צינור צנטריפוגות במשך כ 1 דק 'על מנת להבטיח תסיסה מספקת של התאים וחיץ ולעודד תמוגה של קרום התא. בצלחת גם שחורה 96, להוסיף למאגר תמוגה 100 μl לכל חלק מדגם – פיגום, תקשורת וגם (לשכפל). בחושך, להוסיף של פתרון ה- DNA תא 100 μl לכל הבארות המכילות מאגר תמוגה ומערבבים בעדינות. כולל בארות עם חיץ תמוגה מכיל לא פתרון ה- DNA ו- DNA של התאים כדי לספק שליטה שלילית וחיובית לצלחת גם. שימוש בצלחת-קורא הקרינה, למדוד את הספיגה של הבארs באמצעות 485 ננומטר עירור ופליטת 520 ננומטר. להשוות את הנתונים עם עקומת הסטנדרט שנוצרה מתקני ה- DNA על פי הוראות היצרן. 10. סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ קיבוע (SEM) בצע את השלבים הבאים תחת זרימה למינרית: לאחר 4 שעות, להסיר את כל הפיגומים מהקיבול והמקום שלהם בתוך צלחת 6-היטב חדשה (בארות נפרדות). לשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. בצע את השלבים הבאים על הספסל הפתוח: כל אחד היטב, להוסיף 2 מיליליטר של 1.5% glutaraldehyde v / v בPBS, כדי להבטיח כיסוי של הפיגום מלא. השאר את הצלחת למשך 30 דקות מינימום ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבוע תא. הסר את הפתרון מקבע ולשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. מייבש את הפיגומים עם הגדלת ריכוזים של אתנול במים מזוקקים מתחילה עם 50% v / v, ואחריו 70% v / v ו- 90% v / v. עבור כל ריכוז, submerse מלא הפיגומים בsolution (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 3 דקות. מחק את הפתרון וחזור. ליבש באתנול 100% על ידי submersing מלא הפיגומים בפתרון (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון וחזור. כימי לייבש את הפיגומים באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS) בתוך ארון קטר. לטבול את הפיגומים בHMDS (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. הסר את HMDS וחזור. הסר את HMDS ולאפשר הפיגומים לייבוש. הר הפיגומים של ספחי SEM זמינים מסחרי (במקרה זה ספחי נירוסטה עם כרטיסיות פחמן דבק). כדי להקל על הצפייה בSEM, מעיל הדגימות באמצעות coater זהב-גמגום למשך 2 דקות על מנת להבטיח כיסוי דק ואפילו. דגימות מקום בתוך SEM ולדמיין את פיגומי תא זרע באמצעות קרן אלקטרונים 5 קאב.