Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

1.Scaffold Fabrication en Sterilisatie Los PCL in 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol tot 10% w / v concentratie geven. Zoals beschreven Bosworth et al, 9 electrospin de polymeeroplossing (parameters: 20 kV, 1 ml / uur, 20 cm). En verzamelen uitgelijnd vezels aan de rand van een roterende doorn (600 rpm). Met een scalpel verwijder het lint van de verzamelde vezels en snijd in kortere lengtes – 3 cm (voor troggen en roterende vaten) en 4 cm (voor celkweek inserts) lengtes. Met behulp van fijne tang onderdompelen individuele strips in gedestilleerd water en verwijder. Houd beide uiteinden tussen duim en wijsvinger; handmatig draai de strip totdat het lijkt op draad. Kort onderdompelen deze thread-achtige steiger in gedestilleerd water en leg op een schone, niet-vezelige kaart te drogen. Eenmaal droog, plaats individueel in schone microcentrifugebuisjes en voeg 1 ml 50% v / v ethanol in gedestilleerd water. Sluit het deksel en laat gedurende 24 uur. Opmerking: Voer de volgende stappen onder laminaire stroming: Plaats microcentrifuge buizen in een laminaire stroming kast en zuig 50% v / v oplossing. Te vervangen door 1 ml 70% v / v ethanol in gedestilleerd water, dicht deksels en laat gedurende 24 uur. Herhaal 90% en 100% v / v ethanol in gedestilleerd water (1 ml volumes). Wassen steigers tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 24 uur per wasbeurt (2 x 1 ml). Verwijder PBS en te vervangen door 1 ml celkweek media. Opmerking: Steigers zijn klaar voor gebruik na 24 uur. 2. Het bepalen van Steiger Oppervlakte en Aantal Cellen Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software meet de diameter van de electrospun draad langs zijn lengte om een ​​gemiddelde waarde te bepalen. Stel dat de garen een cilindrische staaf en benaderen de oppervlakte met: Waarbij A = Oppervlakte, r = radius en h = lengte Opmerking: Het oppervlak werd berekend op 18.902800 pm2. Voorts zij opgemerkt dat het werkelijke oppervlak groter zal zijn dan deze berekening als het garen bestaat uit honderden fijne vezels, die het oppervlak toenemen. Dientengevolge een groter aantal cellen moet kunnen hechten aan het schavot. Echter, dit heeft geen invloed op een directe vergelijking tussen de testgroepen worden gemaakt. Bepaal het maximum aantal cellen dat kan hechten aan de steiger blootgestelde oppervlak door: Opmerking: Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software, de diameter van menselijke mesenchymale stamcellen werd bepaald op 20 pm (uitgaande cellen zijn rond), dus in casu aantal cellen = 60.200. 3. Steiger Set-up – Cell Culture Inserts (figuur 1A) Onder laminaire stroming, open de steriele 6-well celkweek inserts en scheiden de kortere ringen met de tanden van de bredere geringd lichamen. Neem de ring met de tanden naar boven gericht. Draperen éénvan 4 cm scaffolds boven het midden van de ring en zorg ervoor dat overlapt aan beide zijden. Neem de geringde lichaam en positie boven de getande ring en steiger en naar beneden drukken zorg ervoor dat de steiger blijftstaan ​​en ligt door het midden van de celkweek insert. Plaats de celkweek insert met steiger in de put van een 6-well, lage bindende plaat. Voeg 10 ml van de cultuur media naar het schavot. 4. Steiger Set-up – Trough (Figuur 1B) Onder laminaire stroming, plaats poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) troggen in afzonderlijke petrischaaltjes en voeg 10 ml van de cultuur media om de trog. Met behulp van een tang draperen één van de 3 cm steigers in de drinkbak, en zorg ervoor zijn lengte ligt parallel aan de trog's langer rand. 5. Steiger Set-up – bioreactorvat (figuur 1C) Onder laminaire stroming, afzien 10 ml steriele PBS door de bioreactorvat'sbelangrijkste haven en laat 10 min. Verwijder de PBS en te vervangen door 8 ml kweekmedium. Met behulp van een tang, plaatst u één van de 3 cm steigers in het vat via de grote poort. Sluit de belangrijkste haven uit. 6. Celtelling Cultuur menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) verkregen uit beenmerg volgens de fabrikant protocol tot passage 4 voor het oogsten. Zuig het materiaal uit een 75 cm 2 kolf met hMSCs afkomstig uit beenmerg (doorgang 4, 80% samenvloeiing). Was de cellen met 10 ml steriele PBS en zuig. Voeg 3 ml trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de cellen losgemaakt van de fles oppervlak. 7 ml kweekmedium om het enzym te inactiveren en breng dit totale volume (10 ml) om een ​​centrifugebuis. Resuspendeer deze celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen homogeen dispergeren cellen in hetmateriaal en de cel agglomeraten (10 ml pipet). Verwijder 20 ul van celsuspensie en transfer naar een haemocytometer. Plaats de haemocytometer onder een lichtmicroscoop en imago op x10 doelstelling. Focus de rasterlijnen en tel het aantal cellen in de 4 x 4 pleinen in elke hoek van het net en die binnen de vierkante vallen en degenen die de rechterhand of onderste grenslijn oversteken. Tellen voor elke set van 4 x 4 vierkantjes (4 tellen per grid). Herhaal de resuspensie en celgetal drie keer (stappen 6,6-6,9). Bereken het gemiddelde celgetal en het bepalen van het volume van de media nodig voor cel resuspensie (cel concentratie 60.200 in 200 pi). Zo bepalen de gemiddelde celtelling van de hemocytometer en bepalen de totale gemiddelde aantal cellen uit de drie afzonderlijke tellingen. Vermenigvuldig dit met 1 x 10 4 tot aantal cellen per ml en vervolgens vermenigvuldigen geven door het totale volume celsuspensie te gevenTal aantal cellen. Gebruik de volgende vergelijking om het volume van dragers die voor resuspensie bepalen: Centrifugeer de celsuspensie bij 241 xg gedurende 5 minuten. 7. Cell Zaaien Zuig het materiaal uit de gecentrifugeerd buis verlaten van de cel pellet en te vervangen door de berekende media volume. Resuspendeer de cellen en media voor een nog mengen. Met behulp van een P200 Gilson pipet langzaam afgeven 200 ui celsuspensie op elke steiger door uitvoering van de punt van de pipet langs de steiger lengte en onder de media vloeistofoppervlak. Laat staan ​​voor 20 min. Voor bioreactor schepen, afzien 200 ul celsuspensie door de belangrijkste haven. Hoogst de resterende 2 ml kweekmedium via de injectiespuit poorten tot een totaal volume van 10 ml. 8. Experimentele Start De bioreactor schepen over te dragen aan de RCC-4DQ bioreactor en ingesteld om te draaien op 9 rpm. TranSfer de well platen met celkweek inserts en drinkbakken, om de shaker plaat en ingesteld om te draaien bij 30 rpm. Breng de well platen met celkweek inserts en dalen op de plank van een cel incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 (statische kweek). 9. DNA-test Bereid oplossingen – lysebuffer, 1x TE-buffer, DNA-normen en cel-DNA werkende oplossing – volgens de instructies van de fabrikant. Na 4 uur, verwijder de monsters uit de incubator en plaats onder laminaire stroming. Verwijder de media fracties van alle monsters en plaatsen in afzonderlijk gekenmerkt centrifuge buizen. Centrifugeer de buizen 241 xg. Verwijder het supernatant en voeg 3 ml lysis buffer. Resuspendeer de oplossing kunnen breken de cel pellet. Behulp van een tang verwijder de steigers en plaats in centrifuge buizen met 3 ml lysis buffer (voor de steigers in de bioreactor schepen, verwijder het schavot voor het opzuigen van het media). Voor steigers gehouden binnen celkweek inserts, eerst bevrijden van de steiger door het snijden van de steiger dicht bij de rand van het inzetstuk met behulp van een scalpel. Voeg 3 ml lysis buffer aan elke steiger bakje en schraap het oppervlak (krachtig bewegen voor de bioreactor schepen). Verwijder de lysis buffer en plaats die afzonderlijk gekenmerkt centrifugebuizen. Vortex elke centrifugebuis gedurende ongeveer 1 minuut voldoende roeren van de cellen te waarborgen en buffer en lysis van de celmembraan te bevorderen. In een zwarte plaat met 96 putjes, 100 ul lysisbuffer per monster fractie – steiger, media en goed (dupliceren). In het donker, voeg 100 ul-DNA-oplossing aan alle putjes met lysis buffer en meng voorzichtig. Inclusief putjes met lysisbuffer die geen DNA en cel-DNA oplossing voor een negatieve en positieve controles voor zowel plate. Met behulp van een fluorescentie-plaat-reader, meet de absorptie van het goeds met 485 nm excitatie en 520 nm emissie. Vergelijk de gegevens met de standaardcurve gegenereerd uit de DNA normen volgens de instructies van de fabrikant. 10. Scanning Electron Microscope (SEM) Fixatie Voer de volgende stappen onder laminaire stroming: Na 4 uur, verwijder alle steigers uit hun tanks en plaats in een nieuwe 6-well plaat (aparte putten). Was de steigers tweemaal met PBS. Voer de volgende stappen op de open bank: Aan elk putje, voeg 2 ml van 1,5% v / v glutaaraldehyde in PBS om volledige dekking van het schavot te garanderen. Laat de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 4 ° C voor mobiele fixatie. Verwijder de fixeeroplossing en was de steigers tweemaal met PBS. Dehydrateer de steigers met toenemende concentraties ethanol in gedestilleerd water beginnend met 50% v / v, gevolgd door 70% v / v en 90% v / v. Voor elke concentratie, volledig onderdompelen de steigers in solution (2 ml) en laat gedurende 3 min. Gooi de oplossing en herhaal. Dehydrateer 100% ethanol volledig onderdompelen de steigers in oplossing (2 ml) en vertrekken voor 5 min. Gooi de oplossing en herhaal. Chemisch droog de steigers met behulp hexamethyldisilazan (HMDS) binnen een zuurkast. Dompel de steigers in HMDS (2 ml) en laat gedurende 5 min. Verwijder de HMDS en herhaal. Verwijder de HMDS en laat de steigers drogen. Monteer de steigers op commercieel beschikbare SEM stubs (in dit geval roestvrijstalen stubs met lijm koolstof tabs). Te verlichten bekijken binnen de SEM, de vacht van de monsters met behulp van een gouden-sputter coater gedurende 2 minuten om te zorgen voor een dunne en gelijkmatige dekking. Leg monsters binnen de SEM en visualiseren van de cel-geplaatste steigers met behulp van een 5 keV elektronenbundel.