可视化的非溶胞胞吐作用<em>新型隐球菌</em>从巨噬细胞用数码光学显微镜
Summary
我们将介绍如何可视化巨噬细胞C。新型隐球菌 （Cn）的相互作用进行实时，特别强调采用数字光学显微镜非溶胞胞吐过程。单独使用这种技术被感染的巨噬细胞可以研究，以确定这种现象的各个方面。
Abstract
巨噬细胞中由新型隐球菌感染的许多方面进行了广泛研究，并很好的定义。然而，尚不清楚一个特定的交互作用是非裂解的胞吐作用。在这个过程中，酵母细胞是由知之甚少机构留下两个巨噬细胞和道道可行释放到细胞外空间。在这里，我们介绍了如何遵循了大量单独感染的巨噬细胞通过时间已过显微镜24小时感染期。受感染的巨噬细胞被容纳在加热室中以在CO 2气氛中附连到显微镜，它提供了相同的条件下的细胞培养孵化器。在线数码显微镜可以提供一台主机和病原体不能从静态图像之间的动态交互的信息。能够想象每个感染细胞可以提供线索，巨噬细胞是如何处理的真菌感染，反之亦然。这种技术ìSA强大的工具，学习，后面的一个复杂的现象的动态。
Introduction
隐球菌细胞和巨噬细胞之间的真菌感染的阶段有据可查1-3。后的酵母细胞被巨噬细胞摄取，各种相互作用，可能会发生：在巨噬细胞可裂解释放其真菌负载到细胞外空间，或者它可以通过其细胞膜4的范围内保持酵母细胞控制感染。非裂解性胞吐作用，一种方法，其中巨噬细胞中擦去一些隐球菌细胞或所有进入周围环境或邻近细胞和宿主和病原体保持存活5：然而，几年前，一个新的结果是由两个独立组中所述-8。一些研究试图了解这种相互作用背后的分子机制，但我们仍然没有十足的把握是什么推动了这一现象。
的能力来捕获实时图像以及随后分析多个侵染编巨噬细胞允许一个回答有关期间真菌感染周围的形态，甚至压力巨噬细胞的关于时间，空间能力，改变非溶胞胞吐作用的物理性质的许多问题。通过使细胞被安置在一个环境是相媲美的一个孵化器，我们就可以一睹巨噬细胞真菌细胞相互作用的动态特性。研究人员已用这种技术来研究该方法的各个组成部分。在此过程中，吞噬体中的作用，用荧光染色和肌动蛋白封闭剂9变得显而易见，而另一组用这种方法来显示，非裂解性胞吐作用被阻断在已经有WASH核蛋白质结构域删除的10个细胞。细胞因子信号传导的效果也已经使用实时显微镜11确定。这一过程并不限定于C。新型隐球菌 ，因为它也被观察到与白色念珠菌，anotheř病原真菌有感染的巨噬细胞12的能力。 这些研究结果说明该方法可以提供丰富的信息，我们所知甚少的领域的例子。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了其中的真菌细胞巨噬细胞的相互作用可以被记录并实时在24小时内进行分析的方法。我们的实验室已使用这个协议来研究许多非裂解性胞吐作用的时间方面，将继续使用实时显微术以确定围绕该过程的形态的组件。
这种技术产生理想的效果，特别应注意在协议的某些步骤。之前被镀夜间细胞密度是重要的，因为太多的细胞可以创建的电影是不可用作运动和…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由美国国立卫生研究院奖5T32AI07506，5R01AI033774，5R37AI033142，5R01AI052733部分支持。
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
