JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Published: November 04, 2014
doi:
10.3791/52065
,
1National Center for Biodefense and Infectious Diseases,George Mason University

Summary

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Abstract

Зубной налет анализы остаются одним из наиболее точных методов прямого количественного определения инфекционных вирионов и противовирусных веществ через подсчета дискретных бляшек (инфекционных единиц и клеточных мертвых зон) в клеточной культуре. Здесь показано, как выполнить основную бляшек, и как отличающиеся накладки и методы могут повлиять образование зубного налета и производства. Обычно твердые или полутвердые наложения субстраты, такие как агароза или карбоксиметилцеллюлоза, были использованы, чтобы ограничить распространение вируса, предотвращая неразборчивое инфекцию через жидкую среду роста. Иммобилизованные накладки ограничить сотовой инфекции в непосредственно окружающей монослоя, что позволяет формирование дискретного счетного очагов и последующего образования бляшек. Чтобы преодолеть трудности, связанные с использованием традиционных накладки, роман жидкость наложения использования микрокристаллической целлюлозы и натрий карбоксиметилцеллюлозу все чаще используется в качестве замены в стандартебляшек. Жидкие наложения налета анализы могут быть легко выполнены либо в стандартных 6 или 12 форматов а пластины в соответствии с традиционными методами и не требуют специального оборудования. Из-за его жидком состоянии и последующей легкости применения и удаления, форматы микрокультуры пластины, альтернативно, может быть использован в качестве быстрого, точного и высокой пропускной альтернативы большего масштаба вирусных титрования. Использование не нагретой вязкой жидкости полимера дает возможность упростить работу, экономит реагенты, инкубатор пространство, и повышает безопасность работы при использовании в традиционных или высоких сдерживания лабораториях как без отопления реагента или стеклянную посуду, необходимые. Жидкие накладки могут оказаться более чувствительными, чем традиционные накладками для некоторых термолабильный вирусов.

Introduction

Точная изоляция и количественное определение жизнеспособных вирусных образцов неизменно продолжающееся исследование цель в вирусологии. Он не был до появления бляшек в 1952, что является средством количественно и качественно рассчитать животных вирусные титры впервые была разработана 1,2. Эта техника была впервые адаптирована и изменена с фага анализов, которые ранее были использованы для расчета титры фондовых бактериофагов в биологии растений 1,2. В то время как альтернативные средства для количественного определения вирусной тех пор были разработаны и адаптированы, таких как иммунологические анализы, флуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии, перестраиваемого зондирования резистивный импульса (TRPS), проточной цитометрии, рекомбинантные репортерных систем, и количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР Qrt) эти методы не в состоянии идентифицировать и количественно репликации компетентных вирионов 1,3. В то время как прогресс в технологиях и методах продолжать совершенствовать и изменять ландшафт; plaquе анализы по-прежнему представляют золотой стандарт в определении вирусных концентрации инфекционных литических вирионов 1,4.

Во время анализа бляшек, сливающийся монослой клеток-хозяев, заражен литической вируса неизвестной концентрации, которая была серийно разведенной в счетной диапазоне, как правило, от 5-100 вирионов. Инфицированные монослои затем покрыта накладываемого иммобилизации среды, чтобы предотвратить вирусную инфекцию от распространения через разбора либо механического или конвекционного потока жидкой среды в процессе размножения вирусов. В то время как твердые или полутвердые накладки, такие как агароза, метилцеллюлозы или карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) традиционно использовались, жидкие накладки становятся все более привлекательной альтернативой с развитием новых жидких накладками, такие как Avicel 5- 7. Зубной налет анализы, использующие жидкий по сравнению с традиционными накладками имеют ряд преимуществ, как наложение может быть заявлварьировали при комнатной температуре, и приложения и снятия значительно легче. Как жидкие накладки не требуют потепления, нежные и термолабильный вирусы могут также оказаться проще бляшки.

После первичного инфицирования и применения иммобилизирующим наложения, отдельных бляшек или зон гибели клеток, начнет развиваться как вирусная инфекция и репликации ограничены в окружающую монослоя. Зараженные клетки будут продолжать цикл репликации лизис-инфекции, в дальнейшем распространяясь инфекцию, в результате чего все больше и больше различных и дискретных бляшек. В зависимости от вирусной кинетики роста и используемой клетки-хозяина, видимый налет, как правило, образуют в течение 2-14 дней. Сотовые монослои могут быть затем подсчитывали с помощью стандартной светлой поле микроскопа, или более, как правило, фиксированной и контрастному по нейтрального красного или кристалла насильственных для того, чтобы легко идентифицировать бляшки невооруженным глазом. Есть большое разнообразие доска встречных пятен доступны, каждый предлагая йОДП конкретные преимущества и недостатки. Кристалл фиолетового обычно добавляют в точке сбора и после фиксации / снятия накладки, обеспечивая быстрый и отчетливый счетчик пятно, который позволяет для идентификации очень маленьких бляшек при смешанной морфологией присутствует. Обычный красный имеет преимущество раннего применения и постоянном контакте с накладкой, что позволяет для мониторинга в реальном времени разработки образование бляшек, что особенно полезно при работе с неизвестным вирусом или репликации кинетики. Мы, однако, обнаружили, что окрашивание, как правило, не в отличие при использовании нейтрального красного. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) тетразолия бромид -2,5-дифенил (МТТ) дает несколько преимуществ, как желтые пятна цветные красители живые клетки темно-синий и вирусные бляшки можно пересчитать без удаления верхнего слоя, как с нейтральным красным. Высокая контрастность между живыми и мертвыми клетками предоставляемых МТТ также позволяет обнаружить небольшие бляшки в более раннем времени точка после заражения, Хотя хранение будет по-прежнему требовать удаления верхнего слоя 8. Как кристаллический фиолетовый можно просто выполнен в растворе воды и спирта, и обеспечивает высокую степень чувствительности к смешанной морфологией бляшек, мы выбрали его в качестве предпочтительного, и упрощенной счетчика пятно на протокол продемонстрировал, как мы используем несколько семейств хорошо охарактеризованные вирусы.

После фиксации и окрашивания зараженный клеточный монослой, бляшки подсчитываются, чтобы титровать образцы вирусов запаса по бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Падение журнала Следует отметить, между серийных разведений и, в зависимости от размера пластины, между 5-100 бляшек, с отрицательным контролем, используемого в качестве ссылки. Статистически образцы будут меняться на 10% на каждые 100 бляшек при сравнении образца повторяет 3. Преимущество использования зубной налет анализов для определения вирусные титры заключается в их способности для количественного определения фактического количества инфекционных вирусных частиц Within образца. Как несколько вирионы могут потенциально заразить одну ячейку, терминология единиц по сравнению с вирионов используется во время налета титрования 1,2.

Налет морфология может варьироваться резко при различных условиях роста, а также между вирусных видов. Налет размер, четкость, определение границы, и распространение все должны быть отмечены как они могут предоставить ценную информацию о росте и факторов вирулентности вируса в вопросе.

Основные принципы анализа бляшек также могут быть адаптированы и модифицированы различными способами, например, в использовании фокус формирования анализов (FFAs). FFAs не полагаться на лизиса клеток и counterstaining обнаружить образование бляшек, а использовать иммуноокрашивания методы непосредственно обнаружить внутриклеточные белки вируса через меченых антител. Повышенная чувствительность, снижение времени инкубации после заражения, а главное способность количественного без литические вирусы все различныПреимущества при использовании FFAs. В то время как широко используется, критические факторы, ограничивающие в FFAs по сравнению с традиционным методом бляшек заключается в необходимости соответствующих антител и способностью только зонд для белковых субъединиц вируса по сравнению с фактическим инфекционных вирионов 4.

Для целей данного исследования, мы ограничим наше обсуждение классических налета анализов и описывают применение традиционных твердых и полутвердых накладками (агарозы и СМС), наряду с новыми жидкость микрокристаллических накладками целлюлозы.

Protocol

1. Подготовка клеток и реактивов День до теста, пластины соответствующих клеток-хозяев для вируса в вопросе (таблица 1 и 2) в 90 – 100% слияния. Подготовка фиксирующий раствор 10% формальдегида в дН 2 O. В примере, смешать 5,56 мл 36% акций формальдегида с 14,44 мл дистиллированной H 2 O (DH 2 O). ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте практика обращения соответствующих безопасных и вентиляция при помощи формальдегида. Подготовка кристаллическим фиолетовым пятном: 1% кристаллическим фиолетовым (CV) в 20% -ном этаноле и Д. 2 O. Подготовьте 2x бляшки носителя (тип клеток зависимую при концентрации 2 х; смотри Таблицу 2). Фильтр с использованием 0,2 мкм фильтр, если какие-либо реагенты не стерильны. Подготовка иммобилизовать накладками (Таблица 3) Для жидких накладками, сделать стерильный 2,4% раствор Avicel в дН 2 O. Для предотвращения образования комков, добавить порошок в колбу, содержащую воду йна быстро смешивания с мешалкой, заливают в Avicel медленно и быстро перемешивают при комнатной температуре (RT). Когда раствор окажется слишком вязким для мешальник до гомогенизации, переключиться на колбу шейкера для> 30 мин с тяжелой агитации для обеспечения равномерного гомогенизации. ПРИМЕЧАНИЕ: растворы могут быть сделаны при более низких концентрациях, но решения могут отделить и нужно будет ремикс для обеспечения гомогенизации. Рабочие растворы Avicel могут быть использованы в пределах от 0,6-3%. После гомогенизации, автоклав решение и магазин запечатанный в РТ. Для агарозы и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) накладок, подготовить маточного раствора в дН 2 O 2% КМЦ или 0,6% агарозы. Смешать с мешалкой и автоклав или микроволновой печи, чтобы привести в раствор. 2. Растворы и инфекции На следующий день после посева, визуально проверить слияния и жизнеспособность клеток до начала анализа. Убедитесь, стандартный клеточной морфологии Aй ~ 90% сливной монослоя присутствует. Выполните десятикратное серийное разведение инфекционных образцов. С помощью сотового питательной среды для размножения вирусов в качестве разбавителя (таблица 2). Вары число разведений необходимых на основе ожидаемой титра вируса в вопросе, и всегда использовать неинфицированных контрольного образца самостоятельно обеспечить сотовой жизнеспособность и помощь в идентификации бляшек. Из серийных разведений, инфицировать клетки в течение 45 мин до 1 ч (таблица 1). Используйте достаточный объем посевного материала для покрытия ячейки, при сохранении объема как можно ниже, чтобы максимально увеличить контакт с вирусной монослоя (таблица 4). Аккуратно каменные плиты каждые 20 мин, чтобы обеспечить даже освещение и предотвратить сотовой монослоя от высыхания. После инфекции, накладывать соответствующий объем иммобилизации среды непосредственно к посевного в скважине (таблица 2) с использованием 1: 1 смесь 2x зубного налета средств массовой информации и immobilizчисле наложение выбора (CMC, агарозы или Авицел). Осторожно перемешать. Для жидких накладками, смешать 1: 1 с утепленным 2x налета СМИ и 1.2 – 2.4% RT фондовом Avicel получить рабочий раствор 0,6-1,2% Avicel наложения среды. Для агарозном наложения, использовать 1: 1 смесь утепленных 2x налета СМИ и исходного раствора с подогревом 0,6% агарозы, место в 56 ° С водяной бане в течение 30 мин, чтобы уравновесить температуру получения конечной концентрации агарозы / наложения 0.3 %. Для КМЦ, подготовить 2% исходного раствора и лечения, как описано в агарозном наложения. При применении накладку на монослое, всегда в равновесие горячей агарозы или CMC в 56 ° C водой, чтобы предотвратить повреждение монослое. Убедитесь решение теплая, но не горячая на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снижение вирусные титры. Большинство агарозные накладки начнет затвердевать ниже 42 ° С, работать быстро и / или подготовить небольшие партии для предотвращения затвердевания при работе. После добавления оверлея, инкубировать пластин для производства различных бляшки, которые явно счетно. Налет формирование может занять 2-14 дней в зависимости от вируса анализируются, таблицу 1. Примечание: После того, как жидкие накладными пластины помещают в инкубатор, не перемещать их. Движение жидкости накладок в течение инкубационного периода приведет к размытыми бляшек. Агарозные и CMC пометки полутвердые и могут быть перемещены или периодически проверять под световым микроскопом, чтобы контролировать развитие бляшек. 3. Крепление и окрашивания клеток Для фиксации клеток, слить или аспирации наложение Avicel, и исправить клетки с помощью 10% -ного раствора формальдегида в течение 30 мин, чтобы в течение ночи (<1 мл на лунку для луночного планшета в 6). Для агарозы или CMC, непосредственно добавить раствор формальдегида в накладкой в ​​течение 1 часа в ночь. Примечание: Образцы могут храниться в течение длительного периода времени в фиксаторе условии, что он делаетне испаряются и высыхают, как это может исказить монослой. До окрашивания и после фиксации, отбросить формальдегид и удалить полутвердые заглушки для агарозы и КМЦ с проточной водой или вручную, или с помощью шпателя. Промыть Avicel бляшки с водой, чтобы удалить остатки наложения / фиксатор перед окрашиванием. Для окрашивания, покрывают клетки с минимальным количеством кристаллического фиолетового раствора в течение ~ 15 мин. Рок плиты при необходимости обеспечить равномерное покрытие. Аккуратно смойте кристаллическим фиолетовым пятном водой. После того, как фиксированной, окрашенных, и сушат, магазин бляшки на неопределенный срок для последующего анализа. 4. Определение титров вируса Граф бляшки в каждую лунку, взяв среднее за любые технические повторов одного и того же разведения. Для больших форматов пластин, скидка скважин с менее чем 5 или больше 100 бляшек. Принять к сведению размер бляшек и морфологии. Отрицательный контроль должен иметь равномерный монослой иможет быть использован в качестве контроля опорной. Определить титр вируса на фондовом образца, принимая среднее число бляшек для разбавления и обратного общего коэффициента разбавления. Примечание: В качестве примера, 30 и 32 бляшек для повторах в 1 х 10 -7 разведений [31 (в среднем) 10 / -7 (разведение) х 0,4 мл (инокулята)] даст титр 7,75 х 10 8 БОЕ / мл.

Representative Results

Способность налета анализов, чтобы точно оценить вирусные титры опирается на многочисленных факторов: соответствующим выбором клетки-хозяина, соответствующих средствах массовой информации и условий роста для сотовых и вирусной жизнеспособности, иммобилизованной вирусного распространения, и точное определение вирусной инкубационного периода, чтобы обеспечить достаточное время для различны и формирование счетная доска. Для этого исследования, вирусы из трех представительных семей были выбраны, чтобы продемонстрировать различия в: наложения отбора, инкубационных периодов, и бляшки морфологии по всей различными типами образцов. Венесуэльский лошадиный энцефалит (VEEV) был выбран в качестве (+) ssRNA вирусной модели, которые могут нанести значительный болезни в лошадиных видов и человека и представляет семью Togaviridae. Грипп B Тайвань штамм, сегментирован (-) вирус ssRNA первую очередь инфицировать людей, представляет семью Orthomyxoviridae. Вирус Рифт-Валли (RVFV), (-) ssRNA членистоногих родился вирус в первую очередь заразить членистоногих,жвачные и люди, была выбрана в качестве представителя семейства буньявирусов. Для RVFV (рисунок 1), титры определяли из исходного раствора рекомбинантного живого ослабленного MP12 штамма RVFV в формате 12 и пластины с использованием CMC, агарозные или AVICEL накладки, которые инкубировали бок о бок в течение после заражения 72 ч (HPI). Представитель пластина показывая разведения, начиная от 10 -4 до 10 -7 можно увидеть в панели А. бляшек с использованием CMC и агарозные накладки показали небольшие, четкие и определенные бляшки с четко определенной круговой границы. Мемориальные доски с жидкой наложения были немного более обильные и больше по сравнению с агарозном и СМС бляшки, и при условии, менее отчетливое границу. Вирусные титры были сравнены в Группе B со всеми накладками выполнении сравнительно. Для того, чтобы получить более четкое визуальное сравнение между накладками для MP12 вместе с большим размером выборки для определения reproducвость, 6 и пластина была также опробована в трех экземплярах (рисунок 2). В формате пластины 6 также, использование накладки CMC показали меньшие, чем любой бляшки агарозных или жидких накладками, которые были сравнимы по размеру друг от друга. В то время как вирусные титры были аналогичны между всеми тремя накладками (Панель D), бляшки, образованные в агарозных и жидких накладками оказалось легче рассчитывать из-за их увеличенного размера. В отличие от RVFV, VEEV титров и бляшки морфологии среди различных накладок варьировалась заметно (рис 3а). Бляшки, образованные в CMC накладками продемонстрировали ясную и четкую морфологию при использовании формата 12-луночного планшета, за счет бляшки размера и чувствительности (панель В). В отличие от CMC, использование агарозных и жидких накладками приводило к значительно более крупные бляшки, указывающий более низкий вирусный ингибирование и повышенную чувствительность к VEEV репликации. Это было ранее подтверждено, когда только сравнивая агарозы в сравнении CMC в аркабан опубликованы Хуарес и др. 4. В то время как агарозные и жидкие накладки производили крупные бляшки, чем CMC, бляшки были плохо определены границы и были трудно рассчитывать на так формате 12, с жидкими накладок, обеспечивающих наибольшую границы распространения. Когда бляшки опробована в 6-луночные планшеты (рисунок 4), тем больше формат хорошо 6 отрицается вопрос открыто крупных бляшек, которые трудно дифференцировать в формате 12 а, с агарозы и жидких накладками, подтверждающих превосходит накладками СМС с точки зрения доска определение и чутко (рис 4D). По сравнению с RVFV или VEEV, грипп предоставляет ряд уникальных трудностей при plaquing, такие, как требование внешнего протеазы. Чувствительность вируса гриппа в различных наложения выборов также были хорошо документированы в прошлом, как значительные изменения были отмечены при модификации как незначительные, как отличающиеся марки агарозы есть бытьан используется 9. Интересно для штамма гриппа B Тайваня, использование CMC в виде наложения привело заметно меньшие бляшки, которые было трудно рассчитывать и оказалось трудно надежно забить (5А). Использование агарозном наложения при условии, лучшие бляшки (Панель С), и в результате более темном фоне пятна (вероятно, из-за повышенной жизнеспособности монослоя), и показали более четких и резких бляшки в непосредственном сравнении с использованием жидкой накладкой (панель B ). Отличительное преимущество жидких полимеров более твердых и полутвердых накладками, таких как агароза и КМЦ, состоит в легкости удаления и применения. Сыры накладки требуют нагрева и кристаллизации может оказаться проблематичным при обращении и удаления. Для того, чтобы заработать на этих преимуществ и для определения целесообразности использования Avicel в высокой пропускной образом для RVFV, 96 Формат хорошо Планшет опробована на различных наложения КонцентрацДополнения (Рисунок 6). Для RVFV MP-12, разведения проводили в четырех повторностях на обоих 0,6 и 1,2% конечной концентрации Avicel. Наложение применение и удаление оказалось простой, без каких-либо очевидных различий между повторами или между концентрациями отмечено, демонстрируя высокую степень воспроизводимости. Когда забил, бляшки были различны и счетная невооруженным глазом, демонстрируя возможности использования жидких накладки в высокой пропускной образом для RVFV. Рисунок 1:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных Veros высевали на 2,5 × 10 5 клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ (Final Concentrations), были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в Группе B. Рисунок 2:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. Три мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели A, B, и C. Отдельные эксперименты проводили, как описано одинаково для панелей переменного тока, с бляшек и титруют в панели D (N = 3). Рисунок 3: <сильные> VEEV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных. Veros высевали на 2,5 × 10 5 клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец вакцинного штамма в VEEV TC-83. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в панели B. Рисунок 4:. V EEV сравнения доска наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец VEEV TC-83. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показанов Панели А, В и С. Отдельные эксперименты проводились одинаково, как описано для панели A – C, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3). Рисунок 5: гриппа зубного налета сравнения наложения MDCK клетки высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и инфицировали 400 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец гриппа В Тайване.. Нет фетальной бычьей сыворотки (FBS) не был использован в ростовой среде или накладок, как ФБС может ингибировать распространение гриппа путем ингибирования определенных протеаз, которые требуются для вирусного слияния. ТРСК-трипсином был добавлен ко всем накладок до применения, чтобы облегчить синтез вирусной и запись с клетками-хозяевами. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ были применены для того, чтобы непосредственно сравнитьпометки, как показано в панели А, В и С. отдельных экспериментов проводились одинаково, как описано в Панели А – С, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3). В то время как в среднем было принято для CMC бляшек они оказались трудно надежно рассчитывать, поскольку они продемонстрировали диффузные границы и очень маленькие размеры бляшек. На рисунке 6:. Высокая пропускная способность налета накладки 96-луночный планшет из Veros высевали при 3 х 10 4 клеток на лунку, были инфицированы 50 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец RVFV MP12 в течение 1 ч, в четырех повторностях. Для накладок, 0,6 и 1,2% конечные концентрации Avicel были опробована в целях определения целесообразности и воспроизводимость использования жидких накладки в высокой пропускной образом, панели А и В, RVFV VEEV Грипп B Тип клетки Веро Веро MDCK Период инфекции 1 час 1 час 45 мин Время инкубации 3 дня 2 дня 3 дня Таблица 1: бляшек инокуляции Условия и Сотовые Типы RVFV VEEV Грипп B Тип клетки Веро Веро MDCK Тип роста DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2 Налет Медиа 2xEMEM 2xEMEM 2xEMEM B 1. Игла в модификации Дульбекко, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина. 2. Игла в модификации Дульбекко среде с добавлением 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,025% HEPES, DEAE-декстран 50 мкг / мл. А. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 5% FBS (25 мл), 1% Минимальные незаменимых аминокислот (5 мл), 1% пирувата натрия (5 мл), 1% L-глутамина (5 мл), 2% Pen / Strep (10 мл). Б. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 1% Минимальный незаменимых аминокислот (5 мл), 50 мкг / мл, 0,025% HEPES, DEAE-декстран, трипсин-ТРСК * * Только до подготовки, добавить 1 мкл на 25мл 2 мкг / мл фондовой из ТРСК-трипсина к аликвотой вы будете использовать для смешивания с агарозы для бляшек. Таблица 2: Налет и Вирусный / Сотовая Рост Medias RVFV VEEV Грипп B Тип клетки Веро Веро MDCK Период инфекции 1 час 1 час 45 мин Время инкубации 3 дня 2 дня 3 дня Наложение решения не истекут, когда сделал так долго, как бесплодие поддерживается. Таблица 3: наложений со 6 хорошо 12 хорошо 96 хорошо # Клеток / лунку 5 х 10 5 2,5 х 10 5 3 х 10 4 Объем инокулята (мкл) 400 200 50 Объем наложения (мл) 3 1,5 0.100 Таблица 4: Пластинчатые форматы

Discussion

Наиболее важным фактором для успешного бляшек заключается в оптимизации протокола для конкретного вируса в культуре в вопросе, как условия могут существенно различаться. Ключевые моменты, которые следует учитывать, являются: провести сотовой совместимость с вирусом в вопросе, соответствующих вирусных условий роста, достаточных диапазонах разбавления для того, чтобы четко различать бляшки, и правильный подбор наложения и окрашивание клеток и вируса в вопросе.

В то время как VEEV и RVFV и расти в очень похожих условиях с использованием многих из тех же типов клеток хозяина, различия в налета морфологии и кинетики роста существенно различаться. При использовании клетки Веро на налета анализов, которые традиционно используются в качестве распространения и индикатора клеточной линии для геморрагических вирусов лихорадки и альфавирусов, VEEV обычно вырастает до высоких титров чем RVFV и демонстрирует увеличилось кинетики репликации, разработке больших единых бляшек на 48 HPI 4, 10 – 12. В отличие от VEEV, RVFV требуется 72 HPI и демонстрирует бляшки, которые, как правило, гораздо меньше, и переменный размер.

В противоположность RVFV и VEEV, вирус гриппа является весьма специфические клетки-хозяина, и может быть трудно распространяться через культуре ткани. Для вируса гриппа, вирусного входа и слияния, как правило, по инициативе связывание рецептора на поверхности клетки с вирусной гликопротеина hamagglutinin (HA), которая является посредником вступление в клетки-мишени путем связывания с α-сиаловой поверхности кислоты рецептора клетки-хозяина. НА представляет собой тример гликопротеин, присутствующий в мембранной оболочке всех вирусов гриппа и требует расщепление в субъединиц HA1 и HA2 по конкретной клетки-хозяина протеазы. Чтобы еще более усложнить вопрос, эти сайты расщепления может часто отличаются вирусных штаммов 13. Как экспрессии протеазы, способные к расщеплению HA ограничивается конкретными тканей, протеазы ARе часто добавляют к среде для культивирования клеток для того, чтобы облегчить синтез вирусной и вступление в выбранной клетке-хозяине, 13. ТРСК-трипсином является одним из примеров широко используемом протеазы, который используется в клеточной культуре с обеих MDCK и клетки Vero: содействие репликацию мульти-цикла (в отсутствие какого-либо инактивации трипсина сыворотки) через активацию протеолитической вирусной HA 14,15.

Как показано в этом исследовании и других, различия в вирусных жизненных циклов могут влиять наложения выборы, форматы плит и раз коллекцию, со значительными отклонениями среди различных классов и видов вирусов. В нашем исследовании, агарозы накладки продемонстрировал более четкие бляшки на более высоких титров, чем любой CMC или жидких накладок для обоих RVFV и вируса гриппа В, усиливая его полезность среди широкого спектра вирусов и типах клеток. Используя низкую конечную концентрацию агарозы большую помощь в удалении твердых пробки и упрощенную окрашивание. CMC в целом продемонстрировал рoorest эффективность в виде наложения на всех трех вирусов проверенных и производимых очень маленькими и нечеткими бляшек на вирус гриппа B. Хотя в целом CMC продемонстрировали наименее желательными характеристиками, его применение в стремительно растет и чрезвычайно вирулентные вирусы могут оказаться выгодным, как это было, кажется, уменьшить размер бляшек только с минимальным снижением титра. Жидкость накладка оказалась наиболее универсальным в том, что он был чрезвычайно прост в приготовлении, увеличилось простоту использования, и был сопоставим с агарозы через все вирусы выбранных. В формате более высокую пропускную способность 96-луночного планшета, применения и удаления не ингибируется в результате затвердевания как с традиционными накладками, и при условии, точные и стабильные результаты. Фактором при использовании жидких накладки заключается в непрозрачной окраски и неспособности контролировать образование бляшек в тарелки не могут быть перемещены до точки сбора, ограничения этого адаптацию к вирусам с ранее характеризующихся кинетики репликации.

<pкласс = "jove_content"> Незначительные изменения в условиях бляшек может существенно изменить результаты, а оценка и эффективность любой новой системы или техники всегда оправдано. В то время как оптимизировать и стандартизированный протокол бляшек не существует для каждой ситуации, наш доклад продемонстрировать универсальность и простоту использования в традиционных, так и новых жидких накладками для налета анализов, обеспечивая при этом достаточную основу для дальнейших модификаций пользователей.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2X EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 oC
MEM 100X  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
  2. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  3. Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
  4. Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
  5. Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
  6. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
  7. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
  8. Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
  9. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
  10. Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
  11. Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
  12. Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
  13. Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
  14. Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
  15. Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).

Tags

Viral ConcentrationPlaque AssayOverlay SystemsAgaroseCarboxymethyl CelluloseLiquid OverlayMicrocrystalline CelluloseViral TitrationHigh ThroughputHeat Labile Viruses

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image