レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、<em>コクヌストモドキ</em

1 T.コクヌスト株式および培養 T.を決定コクヌスト株は実験に使用する。 注：いくつかの研究室に確立T.コクヌスト株が利用可能です。 のGa-1（グルジア-1）ゲノム配列3のために使用されたのGa-2の親株である。 のGa-1（例えば、一塩基多型として、SNPの）株式最もDNA多型のGa-2であるため、と少ないため近親交配へのGa-2よりも健康的である、それは、RNAi実験に最適です。PU-11を使用するか 、別の便利な株である将来ウイング原基におけるそのユニークな強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）の発現が他の幼虫から最後の幼虫齢を区別するために私たちを可能にするので、（クラーク·Hachtel ら 2013 12 図S4を参照）。遺伝的背景が大幅にAFFに表示されるそれは、実験で使用したカブトムシ株を文書化することが重要です電気ショック療法RNAiは13を表現型。 T.を準備（混合した後、-20℃で培養小麦粉を保存）有機全粒小麦粉にあらかじめふるいにかけビール酵母（重量）5％を追加することでコクヌスト培養小麦粉。 6オンスプラスチックショウジョウバエストックボトル（約40グラム/ボトル）を（室温）培養小麦粉を分注し。 文化T.湿度70％、30℃におけるコクヌスト 。湿度制御インキュベーター可能な場合に使用します。培養ボトル当たり30-40大人追加（男性：女性比1：1）培養を開始する。 注：金型はめったに培養小麦粉中のカビの成長を引き起こす可能性があり、30℃湿度70％で、より低い温度（例えば25℃）で問題ありませんが。これが発生した場合の湿度を下げる。 継代培養（培養小麦粉から大人を分離する方法については、ステップ5.2〜5.5を参照）2週間毎に新しい培養ボトルに大人を転送します。 注：終齢幼虫を得るために約3週間かかります。 Alternatively、T.コクヌスト培養は、より長い培養期間ではあるが、より低い温度（20〜25℃）に維持することができる（25℃での発育時間約2倍、30℃である）。 幼虫のdsRNA注射用溶液および楽器の調製 インビトロ転写によって標的遺伝子に相同なdsRNA分子を合成する。 -80℃で保存してください。詳細な分子生物学の手順については、フィリップと寅泰2011 11を参照してください。また、dsRNA分子を設計する際に考慮される必要があるパラメータの数のための説明を参照してください。 1.5ミリリットルの1MのNaH 2 PO 4で8.5 50mlの1MのNa 2 HPO 4を混合することにより（25℃でpH7.6）中0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液10mlを加える。 pH計でpHを確認し、それに応じて調整します。 100 _、（25℃でpH7.6）中0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液10μlを混合して10×注入緩衝液1mlを作る6;リットルの0.5MのKCl、緑の食用色素を100μl、及び二重蒸留水を790μlの（のddH 2 O）である。 2倍注入バッファー（200μlの10×注入緩衝液+800μlののddH 2 O）を作るために10倍の注入バッファーを希釈する。必要になるまで4℃で10倍と2倍の注入·バッファの両方を格納します。 スティッキースライドガラスを準備します。 幼虫注射用の再配置可能な接着剤の形で全体をガラススライドをカバー。大人や蛹の注射のために、スライドの長辺に沿って接着剤の二つの薄いストリップを作る。 また、注入後のそれらの除去を容易にするのに十分柔軟なまま接着剤は、接着剤がスライドにカブトムシを接着するのに十分な粘着性のままであることを保証し、数日間乾燥することができます。 注：接着剤があまりにも粘着性のままの場合、指を使用し、粘着性を低減れる、糊をタップします。各スライドは40または50カブトムシを保持することができ、それがしっかりと動物を保持するために失敗するまで再利用することができます。 Alternテープは、時には幼虫を保持するのに十分な接着剤ではないがatively、両面テープを使用することもできる。 エーテル麻酔バスケットを作成します。 10ミリリットルの使い捨て注射器からプランジャーを外し、6ミリリットル線の周り半分に注射器を切った。 注射器の下半分を捨てる。簡単に説明すると、ガスバーナーで注射器の上部の切断面を加熱して、すぐに注射器の上にメッシュを接着するナイロンメッシュの部分に溶融プラスチックを押してください。プラスチックが硬化後に余分なメッシュを離れてトリミング。 エーテルボトルを準備します。狭い口100または250mlのガラス瓶にエーテル30mlを加える。エーテルの蒸発を高めるためにティッシュペーパーのいくつかの部分を追加する。 注：エーテルは、火災の危険性を提示し、また、有害である。常にヒュームフードの下でエーテルを扱う。使用していないながら、しっかりとふたを閉めます。 注：氷はsedatioが、（そのような教室の設定のように）安全な代替として使用することができますnがあまり効果的である。 幼虫噴射装置の調製解剖顕微鏡上にXYメカニカルステージを配置します。 注：XYメカニカルステージは、主要な顕微鏡の会社から提供されています。あるいは、安価な顕微鏡ステージはまた、いくつかの修正をほとんど解剖顕微鏡のために使用することができる（例えば、材料表を参照）。 XYメカニカルステージに近い機械的針マニピュレータを配置します。 注射器を組み立てます。注射針内の圧力に影響を与えることなく、注射器の操作をできるように、ガラス針ホルダーに30ミリリットル使い捨て注射器を接続するために（ルアー接続を持つ）4方活栓を使用してください（詳細な注射器のためのフィリップと寅泰2011 11を参照してくださいアセンブリ）。 4。引っ張る注射針によるホウケイ酸ガラス針（0.5ミリメートル、長さ15cm：1ミリメートル、ID B100-50-15、OD）を引い針プラー。 注：サッターP-87やP-97は、設定に使用の場合は「熱= 70、= 45、ヴェル= 75、時間= 90を引いて」またはピペットクックブックの第2章は、次のとおりです。付着細胞を、Cを虫 、 ショウジョウバエ 、 ゼブラフィッシュ ＆ -推奨プログラム。最適な設定は、針プラーの機種によって異なります。一般的なショウジョウバエの注射針の設定が良い出発点である。 ストア（ 例えば、プラスチックのCDケース）プラスチックケースに針を引っ張り、取り外し可能な取り付けパテで固定します。 5。単離と幼虫の選択ふるい受信機の上に＃25のふるいを置きます。 ふるい上の培養瓶（カブトムシや文化粉）の内容を置き、すぐに内容をふるいにかける。幼虫はすぐにふるいを通して穴を掘ると動けなくしようとして、ふるい分けすることなく、ふるい上のコンテンツに放置しないでください。積極的に小麦粉落下させるために内容をふるいにかける通し、ふるいの上の背後にある古い幼虫（典型的には6 番目と7 番目の齢幼虫）、蛹および成人（そのキャストオフ甘皮と一緒に、脱皮殻）のままにします。 シードパンにふるい（カブトムシや脱皮殻）上に残っている資料を転送します。逃げるのカブトムシを防ぐために鍋をタップしてください。 優しくシードパンの上に吹き付けることにより甲虫の表面に残った脱皮殻と小麦粉粒子を取り除きます。 鍋の底にコンテンツを移動するために、種パンをタップします。その後、数秒間未開発のパンを残して。山から出てくるように、他のステージよりも移動性で大人のを待ちます。芸術の絵筆（ 例えば、1cmの幅）を使用して、大人を削除します。 蛹が速く、口に向かって転動する傾向があるので、やや下向きにパンの口を維持しながら、静かにシードパンをノックで区切り蛹。シードパンだけ幼虫を残して、蛹を除去するために絵筆を使用してください。 Plのきれいなペトリ皿に孤立した幼虫エース。注射のための幼虫の適切な段階を選択して、個別のペトリ皿に配置します。 注：大人の形態は上だけでなく、変態に対するRNAi効果を分析する際に早期終齢幼虫（最終幼虫脱皮後の1〜2日）は、多くの場合に適しています。しかし、時には必要（ 例えば 、3E-3Hを示します。また、クラーク·Hachtel ら 2013 12参照）は、初期遺伝子機能を評価するために、最後から二番目に（あるいはそれ以前）のステージを、RNAiを行うことである。幼虫の齢を特定するために、サイズの基準と蛹を使用してください。終齢幼虫蛹よりわずかに長い。あるいは、PU-11は、終齢幼虫を識別するだけでなく、終齢幼虫の発達（クラーク-Hachtel 図S4 ら 2013 12）の時間経過を決定するために用いることができる。 エーテル麻酔まで、ペトリ皿内の選択された幼虫を保管してください。残りを置きます幼虫と小麦粉の背中培養ボトルに（例えば蛹と大人のような）カブトムシの他の段階の、インキュベーターに戻す。 注射針の6。準備粘着性のタックや両面テープのいずれかを使用してガラス顕微鏡スライド上に、以前に引っ張らガラス針を配置します。ここで、先端湾曲部を見るために解剖顕微鏡を覗きながら、鉗子を使用して、針の引か終わりをテストします。針は鉗子で曲がるところの先端側に向かってわずかエリアをつかみ、破るねじる。 良い針を保持し、他のものを捨てる​​。それはどちらも大きすぎても小さすぎて開いた良好な針を考慮する（約0.05mm径が図1Aおよび図1B）、及び幼虫のクチクラ容易に（ 図1Bおよび2A-2B）の浸透を作るために傾斜している。 diffi針へのdsRNA液の取り込みを行う、などの悪い針（ⅰ）が小さすぎるを考えるカルト（ステップ7）（ 図1Dおよび2D）、（ⅱ）大きすぎて、注射時の幼虫の傷害および可能な致死を引き起こす（ 図1C及び2F）、（iii）の鈍い、クチクラの浸透を困難にし、怪我を増やす。 ニードルホルダーに針を挿入します。 まず、針ホルダの先端を外し、ホルダー先端に針の後端を置く。次に、（ガラス針の後端から少なくとも1cm）、ホルダー先端の下にゴム製のガスケットを配置します。 完全に針ホルダーの開口部に挿入されたゴム製のガスケットで、ホルダーに針の後部を挿入します。バックホルダーの上にチップをねじ込みます。 針マニピュレータ上に組み立てニードルホルダーを配置します。水平に近い針ホルダを保管してください。 MICRを通して見たときに針の先端がビューの中心に位置するように、マニピュレータの位置を調整しますoscope。 針の中に7前倒しのdsRNAソリューションのddH 2 Oで濃度を調整し、2倍の注入バッファー（ステップ2.3）の等容量のdsRNA溶液を混合することにより直前に注射のdsRNA注射溶液を調製する。氷上で混合溶液を保管してください。 dsRNAの濃度についての説明を参照してください。 20μlの使い捨てピペットチップの先端をカットします。トリミングされたピペットチップへの溶液のピペットを10μl。背圧を提​​供することで、先端に流体を維持しながら、慎重にピペットからピペットチップを取り外します。代わりに、慎重にヒントを削除してから、指を使って圧力を提供することにより、チップの先端にソリューションを移動します。 針の先端が直面している開口部と粘着性のタックを用いた顕微鏡ステージ上のdsRNA溶液でピペットチップを置きます。 顕微鏡で見ると、ゆっくりの先端まで、針に向けてロードされた先端部を移動させる針はちょうどロードされたピペットチップの内側で溶液中にある。 顕微鏡で見ながら、静かにゆっくりと針内のdsRNAソリューションを引っ張って注射器のプランジャに引き戻す。 注：針をオーバーロードしないでください。 dsRNAの溶液の端部が針の先端に近づくにつれて、針の先端が空気に到達する前に、引上げ速度を遅くし、溶液を装填停止。空気が先端に達すると、溶液は速やかに重大な汚染問題をもたらし、針ホルダ内に引き込まれる。針ホルダの詳細なクリーニング手順は、フィリップと寅泰2011 11で説明されています。 ストップコックを開いて、注射器と針ホルダからの圧力を取り除きます。その後、針の先端から離れたピペットチップを移動します。ステージ上に幼虫を配置しながら、誤って針の損傷を防止するために、段階から針を持ち上げます。ステージからの空にピペットチップを取り外します。 </ol> 8 dsRNAをインジェクションエーテル麻酔のバスケットに幼虫を置きます。テクニックを学ぶ場合は、10未満の幼虫を使用してください。技術に一度、快適な1ラウンドで30〜40幼虫を使用してください。 エーテル瓶の中に幼虫をバスケットを置き、ふたを閉じます。 注：エーテルは、火災の危険性を提示し、また、有害である。ヒュームフードの下に、この手順を実行します。 約3分間のエーテル麻酔をかける幼虫。 3分後に移動のための幼虫を確認してください。彼らはまだ動いている場合は、別の30秒、エーテル瓶でそれらをバックに置きます。これは致死性を高めることができるように5分間以上エーテル麻酔をかけるしないでください。 注：最適なエーテル麻酔時間は、温度や湿度に応じて変化し得る。 ガラススティッキースライドの非粘着端にバスケットからエーテル化幼虫を転送します。顕微鏡を見ながら鉗子を使用して、1ずつ幼虫1をピックアップし、スライド上に配置します。 F自分の体を下にタップそっと横にそれらを置き、あなたが行くようにピンセットで尾ロム頭、少し彼らはスライド上に固定されていることを確認するために、それらをストレッチ。 顕微鏡ステージ上の幼虫との粘着性のスライドを置きます。 CNSの損傷を防ぐために、幼虫の背側に静かにdsRNAをロードされた針を挿入します。幼虫の心がここに置かれているとしても、背側正中線を避けてください。この以降では、常に（代わりに針を移動するために、針マニピュレータを使用しての）針に幼虫を移動するためのステージを使用しています。 注：特定の注射部位TのRNAiのように重要ではありませんコクヌストは、全身であるように思われる。しかし、胸部や腹部のセグメントの背側に注入することが通常最も簡単です。 幼虫に針を挿入した後、dsRNAは幼虫の体腔を入力するためのスペースを確保するために、少し戻って針を引く。 幼虫ターン緑（または注入バッファーの色）になるまで注射器を軽く押して、秒を見てtretchedとフル。 注：技術を学ぶ場合、有意な致死性なし幼虫に注入することができる溶液の量を決定するために、できるだけ多くを注入しようとする。これは、一般に約0.5〜0.7μlです。 幼虫から針を外します。針を除去しながら、わずかに（これも空気中に引っ張らないように注意してください）​​のdsRNAの損失を回避するために、注射器に引き戻す。 スライド上のすべての幼虫を注入。成功裏に注入されていなかった幼虫を削除してください。幼虫の前に完全な注入は（約10分で）目を覚ます。 注射顕微鏡から注入された幼虫をスライドを削除し、すべての幼虫がエーテル麻酔から回復するまで、さらに5分間のスライドを残す。 鉗子でと解剖顕微鏡下で、静かに粘着性のスライドからそれらを解放するために先頭から末尾までの幼虫を持ち上げます。きれいなペトリ皿に新しくリリースされた幼虫を置きます。 W注入を可能にするために10〜15分間シャーレ上で幼虫のままにします凝固さound。 適切に系統名を含むクリーン小麦粉とラベルを持つ新しいボトルに幼虫を置き、dsRNAのタイプは、dsRNAの濃度、注入された幼虫の数、および日付を注入した。 文化70％の湿度で30℃で注入した幼虫。定期的にRNAiの表現型のための幼虫を観察します。 注：7日以内に終齢幼虫蛹になる。 （RNAiにより引き起こされるタイミングに異常がない場合）、次に、蛹は7日後に成虫に孵化するであろう。 ノックダウンおよび表現型解析の9。確認そのような定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）とウェスタンブロッティングのようないくつかの異なる分子生物学技術によってノックダウンRNAiの効率性を評価することを検討してください。それぞれ、詳細な定量PCRおよびウエスタンブロットプロトコルに対してMiller ら 2012 7とフィリップと友康2011 11を参照してください。 RNAiの関連表現型を分析します。 注：関連するRNAi表現型は、標的とした遺伝子に応じて、いくつかの異なる段階で、異なる培養条件下で観察することができる。 RNAiは、カブトムシの形態、変態、生理学、行動に影響を与えることができる。どのくらいの頻度で表現型の存在がチェックされ、どのような条件の下でカブトムシが飼育されていることはRNAiを介して調査されて具体的な質問に合わせて調整する必要があります。