Личинок РНК-интерференция в Red мучного жука<em> Tribolium castaneum</em

1 Т. castaneum Акции и Культивирование Принятие решения о Т. Штамм castaneum использовать для эксперимента. ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько лабораторного создана Т. штаммы castaneum доступны. Ga-1 (Грузия-1) является родительский штамм из Ga-2, который был использован для секвенирования генома 3. Так как Ga-1 акции большинства ДНК-полиморфизмы (такие как одиночных нуклеотидных полиморфизмов, SNP) с Ga-2, и здоровее, чем Ga-2 за счет меньшего инбридинга, он идеально подходит для РНК-интерференции экспериментов. Пу-11 еще один удобный штамм использовать , также его уникальная расширенная желтый флуоресцентный белок (EYFP) выражение в будущем крыла зачатков позволяет нам различать последний личиночного возраста от других возрастов (см рис S4 из Кларк-Hachtel др. 2013 12). Важно, чтобы документ, который жука Штамм был использован в эксперименте, как генетический фон по-видимому, значительно AFFЭСТ РНК-интерференции фенотипы 13. Подготовьте Т. castaneum культура муки, добавляя 5% (по весу) дрожжей предварительно просеивают пивных органического цельного зерна муки (после смешивания, хранения культуры муку при -20 ° С). Алиготе культуры муку (при комнатной температуре) в 6 унций пластиковых Drosophila фондовых бутылок (около 40 г / бутылка). Культура Т. castaneum при 30 ° С с 70% влажности. Используйте инкубатор с контролируемой влажностью, если это возможно. Добавить 30-40 взрослых за бутылку культура (Соотношение мужчин и женщин 1: 1), чтобы начать культуру. Примечание: Хотя форма редко является проблемой при 30 ° С, более низкие температуры (например, 25 ° C) 70% влажности может привести к росту плесени в культуральной муки. Опустите влажности, если это происходит. Перенесите взрослых новой бутылке культуры каждые две недели для субкультивирования (см шаг 5,2-5,5 для, как изолировать взрослых от культуры муки). ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет около трех недель, чтобы получить последнего возраста личинок. Alternatраторов, Т. castaneum культуры могут быть при более низкой температуре (20-25 ° С), хотя и с более культивирование период времени (с развитием при 25 ° С приблизительно в два раза, что при 30 ° С). 2 Получение Решения и инструменты для личинок дсРНК инъекций Синтезировать молекулы дцРНК, гомологичные гена-мишени путем транскрипции в пробирке. Хранить при -80 ° С. Смотреть Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детальных процедур молекулярной биологии. Также смотрите обсуждение по ряду параметров, которые необходимо учитывать при проектировании молекулы дцРНК. Сделать 10 мл 0,1 М фосфатного буфера натрия (рН 7,6 при 25 ° С) при смешивании 8,5 мл 1 М Na 2 HPO 4 1,5 мл 1 М NaH 2 PO 4. Проверить значение рН с помощью рН-метра и регулировать соответствующим образом. Сделать 1 мл 10-кратного буфера для инъекций путем смешивания 10 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,6 при 25 ° С), 100 _6; л 0,5 М KCl, 100 мкл зеленого пищевого красителя, и 790 мкл дважды дистиллированной воды (DDh 2 O). Развести буфер 10x впрыска сделать 2x буфер впрыска (200 мкл 10х буфера впрыска + 800 мкл DDH 2 O). Храните оба 10x и 2x впрыска буферов при 4 ° С до использования. Подготовьте Sticky стеклах. Обложка весь стекло с формой перемещаемый клей для личинок инъекций. Для взрослых или куколки инъекций, сделать два тонких полосок клея вдоль длинных краев слайда. Разрешить клей сохнуть в течение нескольких дней, что обеспечивает, что клей остается достаточно липким, чтобы придерживаться жуков на слайде, а также остальные достаточно податливым, чтобы облегчить их удаление после инъекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Если клей остается слишком липким, использовать палец и нажмите на клей, что позволит снизить липкость. Каждый слайд может содержать до 40 или 50 жуков, и могут быть использованы повторно, пока не удается надежно удерживать животных. Alternтельно, двухсторонней ленты также могут быть использованы, хотя иногда лента не клей достаточно, чтобы удерживать личинок. Согласовать эфирным наркозом Корзина. Удалите поршень из 10 мл одноразовый шприц, и сократить шприц пополам вокруг 6 мл линии. Откажитесь нижнюю половину шприца. Вкратце нагревать поверхность разреза верхней части шприца с газовой горелкой, и быстро нажать на расплавленную пластмассу на кусок нейлоновой сеткой, чтобы склеить сетку на шприц. Обрежьте излишки сетку после того, как пластик затвердевает. Подготовьте бутылку эфира. Добавить 30 мл эфира в узкой горловиной 100 или 250 мл стеклянный флакон. Добавить несколько кусочков папиросной бумаги, чтобы добавлять испарение эфира. ПРИМЕЧАНИЕ: Эфир представляет опасность пожара и также вреден. Всегда обращайтесь эфир под вытяжкой. Закройте крышку плотно в то время не используется. ПРИМЕЧАНИЕ: Лед может быть использован в качестве безопасной альтернативы (например, в классной комнате), хотя sedatioN является менее эффективным. 3 Получение личинок инъекций аппарата Разместить механическую стадию XY на вскрытии микроскопом. ПРИМЕЧАНИЕ: XY механическая этапы доступны из основных микроскопических компаний. Кроме того, недорогие этапы микроскопа также может быть использован для большинства рассекает микроскопов с некоторыми изменениями (см таблицу материалов, например). Поместите механическую иглы манипулятор около механической стадии XY. Соберите инъекционный шприц. Используйте четыре-ходовой кран (с Luer соединений) для подключения 30 мл одноразовый шприц к держателю стекла иглы, что позволяет манипулировать шприц для инъекций, не влияя на давление в инъекционной иглой (см Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детального шприц для инъекций монтаж). 4. Тяговая инъекционных игл Потяните боросиликатного стекла иглы (B100-50-15, OD: 1 мм, ID: 0,5 мм, длиной 15 см) поиглы съемник. ПРИМЕЧАНИЕ: Для Саттер Р-87 или Р-97, используйте параметр "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, время = 90" или следовать главу 2 пипетки Cookbook: приверженцем Cell, C. Элеганс, дрозофилы, и данио рерио – Рекомендуемая программ. Оптимальные параметры варьируются в зависимости от модели иглы съемник. Установка для общего Drosophila инъекционной иглы является хорошей отправной точкой. Магазин вытащил иглы в пластиковом корпусе (например, пластмассовый корпус CD) и закрепите со съемной монтажной замазкой. 5 Выделение и выбор личинок Поместите # 25 сито на сито приемника. Поместите содержимое бутылки культуры (жуков и культуры муки) на сито, просеивают и сразу же содержимое. Не оставляйте их содержимое на сито без просеивания, как личинки быстро пытаются зарыться через сито и застряли. Агрессивно просеять содержимое, чтобы мука падениеи оставить через старую личинки (как правило, 6-й и 7-й возрастной стадии личинки), куколки и взрослые (вместе с их литых выключения кутикулы, экзувии) сзади на верхней части сита. Перенесите материалы оставшиеся на сите (жуков и экзувии) к посевной кастрюлю. Продолжайте нажимать кастрюлю, чтобы предотвратить жуков от побега. Извлеките экзувии и частицы муки оставшиеся на поверхности жуков, осторожно дуть над семян сковороде. Нажмите на семенной поддон для перемещения содержимого на дно кастрюли. Тогда, оставить кастрюлю неиспользованный в течение нескольких секунд. Подождите для взрослых, которые более мобильны, чем на других этапах, чтобы выйти из кучи. Удалить взрослых с помощью арт-кисть (например, 1 см в ширину). Отдельный куколки, осторожно стучит семян кастрюлю, сохраняя при этом рот кастрюли немного вниз, как куколок, как правило, свернуть быстрее к устью. Используйте кисть, чтобы удалить куколок, оставив только личинок на семенном кастрюлю. Plтуз изолированных личинок в чистую чашку Петри. Выберите подходящий этап личинок для инъекций и поместить их в отдельный чашке Петри. ПРИМЕЧАНИЕ: В начале прошлого личинки младших возрастов (1-2 день после окончательного личиночной линьки) часто подходит при анализе влияния RNAi на взрослых морфологии, а также на метаморфозы. Он, однако, иногда необходимо выполнить RNAi на предпоследнем (или даже раньше) этап оценить функцию раннего гена (например, рис 3E-3Н. Также Кларк-Hachtel др. 2013 12). Используйте куколок в качестве эталона размером определить возрастной стадии личинок. Последнего возраста личинки немного длиннее куколок. Кроме того, ПУ-11 может быть использован для идентификации личинок последнего возраста, а также для определения временной ход развития последней возрастной стадии личинок (рисунок S4 Кларк-Hachtel и соавт. 2013 12). Держите выбранный личинок в чашку Петри до эфирным наркозом. Поместите все остальноеличинок и других этапах жуков (например, куколок и взрослых) обратно в культуральной бутылки с мукой и вернуть его в инкубатор. 6 Получение инъекционных игл Поставьте ранее вытащил стеклянную иглу на предметное стекло микроскопа, используя либо липкий кнопки или двухсторонний скотч. Использование щипцов, проверить тушеную конец иглы, глядя через вскрытии микроскопом, чтобы увидеть, где верхушка изгибы. Захватите область чуть в сторону наконечника стороне, где игла изгибы с пинцетом и твист сломать. Ведите иглы и выбросить другим. Рассмотрим хорошую иглу как имеющий отверстие, которое не является ни слишком большим, ни слишком маленьким (около 0,05 мм в диаметре. Фиг.1А и 1В), и расположена под углом, чтобы проникновение в личиночной кутикулы проще (фиг.1В и 2A-2B). Рассмотрим плохой иглу как (I) слишком маленький, что делает поглощение раствора дсРНК в иглу Диффикульт (стадия 7) (Фигуры 1D и 2D), (II) слишком велико, в результате чего личинки травмы и, возможно, летальность при инъекции (Фигуры 1C и 2F), (III) тупым, что делает проникновение кутикулы сложной и увеличением травмы. Вставьте иглу в иглодержатель. Во-первых, открутить наконечник иглодержателя и поместите заднюю конец иглы в наконечник держателя. Затем поместите резиновую прокладку под кончиком держателя (по крайней мере, 1 см от задней части стеклянной иглы). Вставьте заднюю часть иглы в держатель, с резиновой прокладкой полностью вставленной в отверстие иглодержателя. Винт наконечник обратно на держатель. Поместите собранный держатель иглы на иглу манипулятора. Держите держатель иглы близкое к горизонтальному. Отрегулируйте положение манипулятора, так кончик иглы находится в центре поля зрения при взгляде через MICRoscope. 7 отдавая дсРНК Решение в иглу Приготовьте раствор для инъекций дсРНК только перед инъекцией путем изменения концентрации с DDh 2 O и смешивания раствора дсРНК с равными объемами 2х буфера впрыска (шаг 2.3). Держите смешанный раствор на льду. Смотреть обсуждение относительно концентрации дсРНК. Отрежьте верхушку 20 мкл одноразовый наконечник пипетки. Внесите 10 мкл раствора в подстриженной кончика пипетки. Тщательно удалить пипетки из пипетки, сохраняя при этом жидкость на конце, обеспечивая противодавление. Кроме того, тщательно удалить кончик, а затем перейти решение до конца наконечника, предоставляя давление с помощью пальца. Поместите кончик пипетки с решением дсРНК на столике микроскопа, используя липкую тактику с открытием к наконечнику иглы. Глядя в микроскоп, медленно перемещайте загруженный наконечник к игле до кончикаигла только внутри загруженного кончика пипетки и в раствор. Глядя в микроскоп, осторожно потяните назад на поршень в шприц для инъекций медленно вытяните решение дсРНК в иглу. ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегружайте иглу. В конец раствора дцРНК приближается к кончик иглы, замедлить скорость вытягивания, и остановки загрузки раствора перед кончиком иглы достигнет воздуха. Если воздух достигает наконечника, решение будет быстро всасывается в держатель иглы, что приводит к серьезным проблемам загрязнения. Подробные процедуры иглодержателе очистки описаны в Филиппа и Tomoyasu 2011 11. Снимите давление со шприца для инъекций и иглодержателя, открыв кран. Затем переместите пипетки от кончика иглы. Поднимите иглу вверх от стадии, чтобы предотвратить случайно повредить иглу при размещении личинок на сцене. Снимите опустели пипетки со сцены. </ol> 8 дсРНК впрыска Поместите личинок в корзине эфирным наркозом. Используйте меньше 10 личинок, если обучения технике. Используйте 30-40 личинок в один тур, как только удобной с техникой. Поместите корзину с личинками в бутылке эфира и закройте крышку. ПРИМЕЧАНИЕ: Эфир представляет опасность пожара и также вреден. Выполните этот шаг под вытяжкой. Etherize личинки около 3 мин. Проверьте личинок для движения через 3 мин. Поместите их обратно в бутылку эфира в течение еще 30 сек, если они все еще движется. Не etherize в течение более 5 мин, так как это может увеличить летальность. ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время эфирным наркозом может изменяться в зависимости от температуры и влажности. Перенести etherized личинок из корзины с антипригарным краю стеклянной липкой слайде. Использование щипцов и, глядя в микроскоп, подобрать каждый личинок по одному и разместить их на предметное стекло. Положите их в стороны и слегка постучите вниз их тела Fром голова к хвосту с пинцетом, слегка растягивая их, как вы идете, чтобы убедиться, что они закреплены на слайде. Поместите клейкую слайд с личинками на столике микроскопа. Вставьте дсРНК загружалась иглу мягко в спинной стороне личинки, чтобы избежать повреждения ЦНС. Также избегайте средней линии спины, как личинки сердце находится здесь. В этом и последующих шагов, всегда использовать сцену для перемещения личинок к игле (вместо использования иглы манипулятор для перемещения иглы). ПРИМЕЧАНИЕ: конкретное место инъекции не имеет значения, как РНК-интерференции в Т. castaneum кажется, системный характер. Тем не менее, это правило, легче всего привнести в спинной стороне грудной или брюшной сегментов. После введения иглы в личинок, вытащить иглу немного назад, чтобы места для дтРНК ввести личинок полость тела. Аккуратно нажмите на шприц для инъекций, пока личинки становятся зелеными (или цвета буфера впрыска) и посмотрите секtretched и полный. ПРИМЕЧАНИЕ: Если обучения технике, попытаться придать как можно больше, чтобы определить количество раствора, который может быть введен в личинку без существенных летальности. Это, как правило, около 0,5-0,7 мкл. Удалите иглу из личинок. При снятии иглы, слегка потяните на себя шприц для инъекций, чтобы избежать потери дсРНК (также будьте осторожны, чтобы не тянуть в воздухе). Введите весь личинок на слайде. Обязательно удалите личинки, которые не были успешно вводят. Полный впрыска до личинок проснуться (примерно 10 мин). Удалить слайд с введенного личинок из инжекционного микроскопом и оставить слайд для получения дополнительной 5 мин, пока все личинки не оправиться от эфирным наркозом. С пинцетом и под микроскопом рассекает, осторожно поднимите личинок от головы до хвоста, чтобы освободить их от липкой слайде. Поместите недавно выпущенный личинок в чистую чашку Петри. Оставьте личинок на чашку Петри в течение 10-15 мин, чтобы позволить инъекции маскруглый свернуться. Поместите личинок в новый флакон с чистой муки и соответствующим образом этикетке, включая имя штамма, тип дцРНК вводят, концентрацию дцРНК, количество впрыскиваемого личинок и дату. Культура вводили личинки при 30 ° С с 70% влажности. Соблюдайте личинок для РНК-интерференции фенотипов регулярно. ПРИМЕЧАНИЕ: последняя возрастная стадия личинки окукливаются в течение 7 дней. Затем, куколки будет eclose во взрослых особей через 7 дней (если нет аномалии по времени, вызванные RNAi). 9 Подтверждение нокдаун и фенотипических анализов Рассмотреть вопрос об оценке эффективности РНК-интерференции сбить несколько различных методов молекулярной биологии, таких как количественного обратной транскрипции-ПЦР (QRT-PCR) и вестерн-блоттинга. Смотреть протокол Miller и соавт. 2012 7 и Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детального кПЦР и вестерн-блот, соответственно. Анализ RNAi связанные фенотипы. ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-интерференции связанныхфенотипы могут наблюдаться при нескольких различных этапах и при различных условиях культивирования, в зависимости от генов, которые были направлены. РНК-интерференция может повлиять на жука морфология, метаморфоз, физиологию и поведение. Как часто наличие фенотипа проверяется и при каких условиях жуки воспитываемых должны быть приспособлены к конкретным вопросам, расследуется через РНК-интерференции.