Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer,<em> Tribolium castaneum</em

1. T. castaneum Aktien und Anzucht Entscheiden Sie sich für eines T. castaneum Stamm für das Experiment zu verwenden. HINWEIS: Mehrere Labor etablierten T. castaneum Stämme sind verfügbar. Ga-1 (Georgia-1) ist der elterliche Stamm von Ga-2, die für die Genomsequenzierung 3 verwendet wurde. Da Ga-1 teilt die meisten DNA-Polymorphismen (wie Single-Nukleotid-Polymorphismen, SNPs) mit Ga-2 und ist gesünder als Ga-2 durch weniger Inzucht, ist es ideal für RNAi-Experimente. Pu-11 ist eine weitere Belastung bequem zu bedienen , als seine einzigartige verbesserte gelb fluoreszierende Protein (EYFP) Ausdruck in der Zukunft Flügel Primordia erlaubt uns, die letzten Larvenstadium von anderen Stadien zu unterscheiden (siehe Abbildung S4 der Clark-Hachtel et al. 2013 12). Es ist wichtig zu dokumentieren, welche Käfer-Stamm in dem Experiment verwendet wurde, wie genetischen Hintergründen erscheinen deutlich affect die RNAi Phänotypen 13. Bereiten T. castaneum Kultur Mehl durch Zugabe von 5% (nach Gewicht) von Pre-gesiebt Bierhefe zu Bio-Vollkornmehl (nach dem Mischen, speichern Sie die Kultur Mehl bei -20 ° C). Aliquot der Kultur Mehl (bei ​​Raumtemperatur) in 6 Unzen Kunststoff Drosophila Vorratsflaschen (ca. 40 g / Flasche). Kultur T. castaneum bei 30 ° C mit 70% Feuchtigkeit. Verwenden Sie eine feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator, wenn möglich. Fügen 30-40 Erwachsene pro Kulturflasche (männlich: weiblich Verhältnis 1: 1), um die Kultur zu starten. HINWEIS: Obwohl Form ist selten ein Problem bei 30 ° C niedrigere Temperaturen (wie 25 ° C) mit 70% Luftfeuchtigkeit kann Schimmelpilzwachstum in der Kultur Mehl verursachen. Senken Sie die Luftfeuchtigkeit, wenn dies geschieht. Übertragen Sie die Erwachsenen zu einer neuen Kulturflasche alle zwei Wochen zur Subkultivierung (siehe Schritt 5,2-5,5 damit wie Erwachsene aus Kultur Mehl zu isolieren). HINWEIS: Es dauert etwa drei Wochen, um die letzten Larvenstadium zu erhalten. Alternathungsweise, T. castaneum Kulturen bei einer niedrigeren Temperatur (20-25 ° C) mit einer längeren Kultivierung Zeitraum aufbewahrt werden, wenn auch (Entwicklungszeit bei 25 ° C etwa doppelt so bei 30 ° C). 2. Herstellung von Lösungen und Instrumente zum Larven dsRNA Injektion Synthese von dsRNA-Moleküle homolog zu der Ziel-Gens durch in vitro-Transkription. Bei -80 ° C. Siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte molekularbiologische Verfahren. Siehe auch Diskussion für eine Anzahl von Parametern, die berücksichtigt werden müssen bei der Entwicklung dsRNA-Moleküle. Machen 10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C) durch Mischen von 8,5 ml 1 M Na 2 HPO 4 mit 1,5 ml 1 M NaH 2 PO 4. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter und entsprechend anpassen. Auffüllen auf 1 ml 10x Injektionspuffer durch Mischen von 10 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C), 100 _6; l 0,5 M KCl, 100 ul grüne Lebensmittelfarbe, und 790 ul doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Verdünnen Sie die 10x Injektionspuffer auf 2x Injektionspuffer (200 ul 10x Injektionspuffer + 800 ul ddH 2 O) zu machen. Lagern, 10x und 2x Injektionspuffer bei 4 ° C, bis sie benötigt. Bereiten Sticky Glasobjektträger. Decken eine ganze Glasträger mit einer Form von Haftkleber für Larven Injektionen. Für Erwachsene oder Puppen Injektionen, machen zwei dünne Streifen von Kleber entlang den längeren Kanten der Folie. Der Kleber für mehrere Tage, was sicherstellt, dass der Kleber klebrig bleibt genug Käfer zu der Folie haften zu trocknen, aber auch biegsam genug ist, um deren Entfernung nach der Injektion erleichtern bleibt. HINWEIS: Wenn der Kleber bleibt zu klebrig, mit einem Finger, und tippen Sie auf den Leim, die die Klebrigkeit verringern. Jede Folie kann bis zu 40 oder 50 Käfer zu halten, und kann wiederverwendet werden, bis es nicht sicher zu halten, die Tiere. Alterntiv kann doppelseitiges Klebeband verwendet werden, wobei das Band manchmal nicht genug, um die Larven zu halten Klebstoff. Machen Sie ein etherization Korb. Entfernen Sie den Kolben aus einer 10 ml Einwegspritze, und schneiden Sie die Spritze in die Hälfte der ganzen Linie 6 ml. Entsorgen Sie die untere Hälfte der Spritze. Kurz erhitzen die Schnittfläche des oberen Teils der Spritze, die mit einem Gasbrenner, und schnell schieben der geschmolzene Kunststoff auf einem Stück Nylonnetz, das Netz auf die Spritze zu kleben. Schneiden Sie den über Mesh, sobald der Kunststoff aushärtet. Bereiten Sie die Äther-Flasche. 30 ml Äther in einen schmalen Mund-100 oder 250 ml Glasflasche. Fügen mehrere Stücke von Tissue-Papier, um die Verdampfung des Ethers zu verbessern. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Immer Äther behandeln unter einer Abzugshaube. Schließen Sie den Deckel fest, während nicht in Gebrauch ist. HINWEIS: Ice kann als sicherere Alternative (wie in einem Klassenzimmer) verwendet werden, obwohl die sedation ist weniger effektiv. 3. Herstellung von Larven Pritzvorrichtung Ein XY-Kreuztisch auf einem Binokular. HINWEIS: XY Kreuztische sind über führende Unternehmen Mikroskop. Alternativ können kostengünstig Mikroskoptische auch für die meisten Sezieren Mikroskope mit einigen Modifikationen verwendet werden (siehe Tabelle Werkstoffe zum Beispiel). Legen Sie eine mechanische Nadel Manipulator in der Nähe der XY-Kreuztisch. Montieren Sie eine Injektionsspritze. Verwendung einer Vierwegehahn (mit Luer-Verbindungen), um eine 30 ml Einwegspritze auf eine Glasnadelhalter zu verbinden, so dass Manipulation der Injektionsspritze, ohne den Druck in der Injektionsnadel (siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für die detaillierte Injektionsspritze Montage). 4. Ziehen Injektionsnadeln Ziehen Borosilikatglas Nadeln (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm Länge), die durch einNadelmagnet. HINWEIS: Sutter P-87 oder P-97, verwenden Sie die Einstellung "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90" oder folgen Sie Kapitel 2 der Pipette Cookbook: adhärenten Zell, C. elegans, Drosophila, Zebrafisch und – Empfohlene Programme. Die optimalen Einstellungen variieren je nach Modell von der Nadel abziehen. Die Einstellung für eine generische Drosophila Injektionsnadel ist ein guter Ausgangspunkt. Shop gezogen Nadeln in einem Kunststoffgehäuse (zB ein Kunststoff CD-Hülle) und mit abnehmbaren Montage Kitt. 5. Isolierung und Selektion von Larven Legen Sie ein # 25-Sieb auf ein Sieb Empfänger. Legen Sie die Inhalte der Kulturflasche (Käfer und Kultur Mehl) auf dem Sieb und sichten den Inhalt sofort. Die Inhalte auf dem Sieb ohne Sichtung Lassen Sie nicht, wie Larven werden schnell versuchen, durch das Sieb zu graben und nicht weiterkommen. Aggressiv zu sichten den Inhalt in das Mehl fallen lassendurch und lassen ältere Larven (in der Regel 6 und 7. Larvenstadium), Puppen und Erwachsene (zusammen mit ihren abgelegten Nagelhaut, exuviae) hinter auf dem Sieb. Übertragen Sie die auf dem Sieb verbleibenden (Käfer und exuviae) auf den Samen Pfanne Materialien. Klopfen Sie die Pfanne, um die Käfer an der Flucht zu verhindern. Entfernen Sie die exuviae und die Mehlpartikel auf der Oberfläche verbleibenden der Käfer durch sanft weht über dem Samen Pfanne. Tippen Sie auf das Saatgut Pfanne, um den Inhalt auf den Boden der Pfanne zu bewegen. Dann lassen Sie die Pfanne ungenutztes für einige Sekunden. Warten Sie, bis die Erwachsenen, die mobiler als andere Stufen sind, um aus dem Stapel heraus. Erwachsene zu entfernen, indem ein Kunst Pinsel (beispielsweise 1 cm Breite). Separate Puppen durch leichtes Klopfen den Samen Pfanne, während die Mündung der Pfanne leicht nach unten, als Puppen sind in der Regel schneller zum Mund rollen. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Puppen zu entfernen, so dass nur die Larven auf dem Saatgut Pfanne. PlAce den Larven isoliert in einem sauberen Petrischale. Wählen Sie einen geeigneten Stadium der Larven für die Injektion und legen Sie sie in einem separaten Petrischale. HINWEIS: Anfang letzten Larvenstadium (1-2 Tage nach der letzten Häutung der Larven) sind oft geeignet, wenn die Analyse der RNAi-Effekt auf die Erwachsenen Morphologien sowie Metamorphose. Es ist jedoch manchmal notwendig, RNAi bei der vorletzten zuführen (oder früher) Stufe zur frühen Gen-Funktion zu bewerten (beispielsweise, 3E-3H. Siehe auch Clark-Hachtel et al. 2013 12). Verwenden Puppen als Referenzgröße, um die Larvenstadium der Larven zu identifizieren. Das letzte Larvenstadium sind etwas länger als Puppen. Alternativ können PU-11 verwendet, um die letzten Larvenstadium zu identifizieren sowie den zeitlichen Verlauf der Entwicklung des letzten Larvenstadium (Abbildung S4 in Clark-Hachtel et al. 2.013 12) zu bestimmen. Halten Sie die ausgewählten Larven in einer Petrischale bis etherization. Legen Sie den Restder Larven und auf anderen Stufen der Käfer (wie Puppen und Erwachsene) wieder in eine Kulturflasche mit Mehl und bringen Sie es in den Inkubator. 6. Herstellung von Injektionsnadeln Legen Sie eine zuvor zog Glas Nadel auf einen Glasobjektträger entweder klebrig oder doppelseitiges Klebeband. Mit einer Pinzette, testen Sie die zog Ende der Nadel während Sie durch den Binokular, wo die Spitze biegt sehen. Besorgen Sie sich die Fläche, die etwas in Richtung der Spitze der Seite, wo die Nadel biegt mit der Zange und Wendung zu brechen. Halten gute Nadeln und verwerfen andere. Betrachten wir eine gute Nadel mit einer Öffnung, die weder zu groß noch zu klein (etwa 0,05 mm Durchmesser. 1A und 1B) und ist abgewinkelt, um das Eindringen der Larvencuticula einfacher (1B und 2A-2B) zu machen. Betrachten Sie eine schlechte Nadel (i) zu klein, so dass die Aufnahme der dsRNA-Lösung in die Nadel schwieKult (Schritt 7) (1D und 2D), (ii) zu groß ist, was zu Verletzungen und Larven möglich Letalität bei der Injektion (1C und 2F), (iii) stumpf, so dass das Eindringen der Nagelhaut schwierig und zunehmende Verletzung. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter. Zuerst schrauben Sie die Spitze des Nadelhalters und legen Sie das hintere Ende der Nadel in die Halterung Spitze. Legen Sie dann die Gummidichtung unter dem Halter Spitze (mindestens 1 cm vom hinteren Ende des Glas Nadel). Die Rücken der Nadel in die Halterung, mit der Gummidichtung vollständig in die Öffnung des Nadelhalters eingeführt. Schrauben Sie die Spitze zurück auf den Halter. Legen Sie die zusammengebauten Nadelhalter auf die Nadel Manipulator. Halten Sie den Nadelhalter in der Nähe von horizontal. Stellen Sie die Position des Manipulators, so dass die Spitze der Nadel in der Mitte der Ansicht befindet, wenn Sie durch den MICRoscope. 7. Frontloading dsRNA-Lösung in die Nadel Bereiten Sie die dsRNA Injektionslösung unmittelbar vor der Injektion durch Einstellen der Konzentration mit ddH 2 O und Mischen des dsRNA-Lösung mit gleichen Volumina 2x Injektionspuffer (Schritt 2.3). Halten Sie die Mischlösung auf Eis. Siehe Diskussion über die dsRNA-Konzentration. Schneiden Sie die Spitze eines 20 ul Einweg-Pipettenspitze. Je 10 ul der Lösung in die Pipettenspitze getrimmt. Entfernen Sie vorsichtig den Pipettenspitze aus der Pipette, während die Flüssigkeit an der Spitze durch Gegendruck. Alternativ entfernen Sie vorsichtig die Spitze und bewegen Sie dann die Lösung für das Ende der Spitze durch Druck mit einem Finger. Die Pipettenspitze mit der dsRNA-Lösung auf dem Mikroskoptisch mit klebrig mit der Öffnung nach die Spitze der Nadel. Blick durch das Mikroskop, langsam bewegen die geladene Spitze in Richtung der Nadel, bis die Spitze desNadel ist nur innerhalb des geladenen Pipettenspitze und in die Lösung. Während der Blick durch das Mikroskop, ziehen Sie den Kolben der Injektionsspritze langsam ziehen die dsRNA-Lösung in die Nadel. HINWEIS: Überladen Sie die Nadel. Als das Ende der dsRNA Lösungsansätze die Spitze der Nadel, verlangsamen die Rate zu ziehen und das Laden der Lösung vor der Spitze der Nadel würde Luft zu erreichen. Wenn Luft die Spitze erreicht, wird die Lösung schnell in den Nadelhalter gezogen werden, was zu schweren Kontamination Fragen. Detaillierte Reinigungsverfahren des Nadelhalters in Philip und Tomoyasu 2011 11 beschrieben. Entfernen Sie den Druck aus der Injektionsspritze und Nadelhalter durch das Öffnen der Hahn. Dann bewegen Sie die Pipettenspitze von der Spitze der Nadel. Heben Sie die Nadel aus der Bühne, um nicht versehentlich zu beschädigen die Nadel beim Aufsetzen der Larven auf der Bühne. Entfernen Sie die geleert Pipettenspitze von der Bühne. </ol> 8. dsRNA Injektion Legen Sie die Larven in die etherization Korb. Nutzen weniger als 10 Larven, wenn das Erlernen der Technik. Verwenden Sie 30-40 Larven in einer Runde einmal bequem mit der Technik. Platzieren Sie den Korb mit Larven im Äther-Flasche und den Deckel schließen. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Führen Sie diesen Schritt unter einer Abzugshaube. Etherize Larven für etwa 3 min. Überprüfen Sie die Larven für die Bewegung nach 3 min. Legen Sie sie zurück in den Äther-Flasche für weitere 30 sec, wenn sie noch in Bewegung sind. Nicht länger als 5 min Etherize da dies Letalität erhöhen. HINWEIS: Die optimale etherization Zeit kann je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren. Übertragen Sie die veretherte Larven aus dem Korb auf die Antihaft-Kante einer Glas klebrige Folie. Mit einer Pinzette und, während Sie durch das Mikroskop, nehmen Sie jede Larven eine nach der anderen und legen Sie sie auf die Folie. Legen Sie sie seitlich und klopfen Sie leicht nach unten ihre Körper from Kopf bis Schwanz mit der Zange, leicht Stretching ihnen, wie Sie gehen, um sicherzustellen, dass sie auf der Folie gesichert. Legen Sie die klebrige Rutsche mit Larven auf dem Mikroskoptisch. Legen Sie die dsRNA geladen Nadel vorsichtig in die dorsale Seite der Larven verhindert die Beschädigung des ZNS. Vermeiden Sie auch die Rückenmittellinie, da die Larven Herz befindet sich hier. In dieser und den folgenden Schritten immer die Bühne, um die Larven zu der Nadel (anstatt die Nadel Manipulator, um die Nadel zu bewegen) zu bewegen. HINWEIS: Die spezifische Injektionsstelle nicht als RNAi Rolle in T. castaneum erscheint systemischen sein. Jedoch ist es üblicherweise am einfachsten in die dorsale Seite der Brust-und Bauchsegmente injizieren. Nach dem Einlegen der Nadel in die Larven, ziehen Sie die Nadel leicht wieder auf Raum ermöglichen die dsRNA die Larvenkörperhöhle zu gelangen. Drücken Sie leicht auf die Injektionsspritze, bis die Larven wiederum grün (oder der Farbe des Injektionspuffer) und suchen stretched und voll. Hinweis: Wenn das Erlernen der Technik versuchen, so viel wie möglich zu injizieren, um die Menge der Lösung, die in eine Larve ohne signifikante Letalität injiziert werden kann bestimmen. Es ist im allgemeinen etwa 0,5-0,7 ul. Entfernen Sie die Nadel aus der Larven. Beim Entfernen der Nadel leicht wieder auf die Injektionsspritze auf dsRNA Verlust zu vermeiden ziehen (auch darauf achten, nicht in der Luft zu ziehen). Injizieren alle Larven auf der Folie. Achten Sie darauf, Larven, die nicht erfolgreich injiziert wurden, zu entfernen. Vollständige Injektion vor Larven aufwachen (in ca. 10 min). Entfernen Sie den Schlitten mit eingespritzt Larven aus der Einspritz Mikroskop und lassen Sie die Folie noch 5 Minuten, bis alle Larven erholen sich von der etherization. Mit Pinzette und unter einem Binokular, heben die Larven von Kopf bis Schwanz, um sie von der klebrigen Schieber freizugeben. Legen Sie die neu veröffentlichten Larven in einer sauberen Petrischale. Verlassen Sie die Larven auf der Petrischale für 10-15 min, um die Injektion w ermöglichenound gerinnen. Legen Sie die Larven in eine neue Flasche mit sauberem Mehl und Etikett entsprechend der Belastung einschließlich Name, die Art der dsRNA injiziert, der Konzentration der dsRNA, die Anzahl der Larven injiziert und das Datum. Kultur der injizierte Larven bei 30 ° C mit 70% Luftfeuchtigkeit. Beachten Sie die Larven für RNAi-Phänotypen regelmäßig. Hinweis: Die letzten Larvenstadium verpuppen sich innerhalb von 7 Tagen. Dann werden die Puppen zu Erwachsenen nach 7 Tagen schlüpfen (wenn es keine Abnormalität in Zeit durch RNAi verursacht). 9. Bestätigung des Knockdown und phänotypische Analysen Sehen Beurteilung Effizienz RNAi knock down von verschiedenen molekularbiologischen Techniken, wie quantitative reverse Transkription-PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Siehe Miller et al. 2012 7 und Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte qPCR und Western Blot-Protokoll auf. Analysieren RNAi-Phänotypen im Zusammenhang. HINWEIS: RNAi verwandtenPhänotypen können in verschiedenen Stadien und bei verschiedenen Kulturbedingungen beobachtet werden, abhängig von den Genen, die gezielt wurden. RNAi kann den Käfer Morphologie, Metamorphose, Physiologie und Verhalten beeinflussen. Wie oft die Anwesenheit von Phänotyp wird überprüft und unter welchen Bedingungen die Käfer aufgezogen werden sollten, um den spezifischen Fragen zugeschnitten werden sie durch RNAi untersucht.