幼虫RNA干扰在赤拟谷盗，<em>赤拟谷盗</em

1，T。盗股票和培养决定一个T。盗菌株用于该试验。 注：有几个实验室建立的T。盗菌株是可用的。 嘎-1（佐治亚-1）为Ga-2亲本菌株用于基因组测序3这一点。由于Ga的1股大部分的DNA多态性（如单核苷酸多态性，单核苷酸多态性）与镓-2，并且比Ga的2健康由于较少近亲繁殖，这是理想的RNAi实验。PU-11是另一种方便的菌株用作为它的独特的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）表达在未来翅原基使我们能够区分来自其它龄期的最后的幼虫龄期（见的克拉克-Hachtel 等人 2013 12 图S4）。它记录其甲虫菌株在实验中使用是很重要的，因为遗传背景出现显著AFF等了RNAi的表型13。 准备T。通过加入预先过筛的啤酒酵母的5％（按重量计），以有机全麦面粉（混合后，储存在-20℃下培养面粉） 盗培养面粉。等分的培养面粉（在室温下）为6盎司塑料果蝇库存瓶（约40克/瓶）。 文化T。拟谷盗 ，在30℃用70％的湿度。使用湿度控制孵化器如果可能的话。添加30-40成年人每培养瓶（男女比例1:1），开始培养。 注意：虽然模具是很少的问题，在30℃下，较低的温度（如25℃），用70％的湿度会导致霉菌生长在培养面粉。降低湿度，如果发生这种情况。 转大人到一个新的培养瓶每两周传代培养（参见如何隔离成年人从文化面的步骤5.2-5.5）。 注意：这需要大约三个星期，以获得末龄幼虫。 Alternat结构延续，T。盗培养物可以保持在较低的温度下（20-25℃），尽管更长的培养时间（发育时间在25℃时是大约两倍于30℃下）。 2，准备解决方案和仪器幼虫双链RNA注射液合成的dsRNA分子的同源性通过体外转录的靶基因。储存在-80℃。看到菲利普和泰2011 11进行详细的分子生物学方法。另请参阅讨论了一些需要加以考虑设计的双链RNA分子，当参数。 通过混合8.5毫升的1M的Na 2 HPO 4用1.5ml的1M的NaH 2 PO 4的制作将10ml 0.1M磷酸钠缓冲液（pH 7.6，在25℃）。检查用pH计的pH值，并相应地调整。 使加入1ml 10×喷射缓冲器通过将10微升的0.1M磷酸钠缓冲液（pH 7.6，在25℃），100 _6;升0.5M的氯化钾，加入100μl的绿色食用色素，和790微升双蒸水（DDH 2 O）。稀释10倍注射缓冲液，使2个注射缓冲液（200微升10X注入缓冲液+ 800微升DDH 2 O）。同时存储10倍和2倍注射液缓冲在4°C，直到需要的。 准备粘载玻片上。 支付与重新定位的胶水幼虫注射一种形式的整个载玻片。对于成人或蛹注射，使两个薄带的胶水沿着滑动的长边。 使胶水干燥数天，这保证了胶保持足够粘性附着甲虫在滑动的同时，也保持足够的柔性，以方便注射后除去它们。 注：如果胶水停留太粘，用手指轻点上胶，这将减少粘性。每个滑动可以容纳多达40个或50个甲虫，并且可以重复使用，直到它不能可靠地保持动物。 ALTERNatively，双面胶带也可以使用，虽然在磁带有时无粘性足以容纳幼虫。 做一个醚化篮。 除去从10ml的一次性注射器的柱塞，并切断所述注射器中的一半左右的6毫升线。 弃去底部的注射器的一半。简要地加热用气体燃烧器将注射器的顶端部分的切割表面，并迅速推向熔化塑料到一张尼龙网的粘合网眼到注射器中。修剪掉多余的网状一旦塑料变硬。 准备乙醚瓶。加入30ml乙醚成窄口100或250 ml玻璃瓶。加入几片纸巾，以提高醚的蒸发。 注：乙醚提出了火灾隐患，也是有害的。在通风橱总是处理醚。紧密而无法合上盖子使用。 注：冰可以作为一个更安全的替代（如在课堂环境中），虽然sedation是不那么有效。 3，制备幼虫喷射装置发布XY机械平台上解剖显微镜。 注：XY机械阶段，可从主要的显微镜公司。备选地，廉价显微镜阶段也可用于大多数解剖显微镜具有一些修改（见材料表为例子）。 广场附近的XY机械舞台机械针操纵。 组装的注射器。使用四通活栓（带Luer连接）到30ml的一次性注射器连接到玻璃针保持架，使操纵注射器的，而不会影响在注射针的压力（见菲利普和泰2011 11为详细注射器组装）。 4，牵引注射针头由拉硼硅玻璃针（0.5毫米，长15厘米B100-50-15，外径：1毫米，ID）针拔。 注：对于萨特的P-87或P-97，使用设置“热火= 70，拉= 45，威赛= 75，时间= 90”，或按照移液器食谱第2章：贴壁细胞，C。线虫 ， 果蝇 ， 斑马鱼及-推荐程序。最佳设置取决于针拉马的模型。设定一个通用的果蝇注射针是一个很好的起点。 商店拉针在塑料外壳（ 如塑料CD盒），并带有可拆卸安装腻子固定。 5，分离与筛选幼虫放置一个＃25筛上筛接收器。 将培养瓶（甲虫和培养面粉）在筛上的内容，并立即过筛的内容。不要留在筛上的内容而不进行筛选，因为幼虫会迅速尝试挖洞通过筛板和卡住。积极筛选的内容，让面粉下跌通过和离开旧的幼虫（一般为6 次和第 7 次龄幼虫），蛹和成虫（连同其抛弃的角质层，蜕皮）后在筛上的顶端。 传送保留在筛（甲虫和蜕皮）到种子盘的材料。请敲击锅，以防止甲虫逃逸。 取出蜕皮和轻轻拂动种子盘剩余的甲虫表面的面粉颗粒。 点击种子潘移动内容到锅底。然后，离开盘未开发的几秒钟。等待大人，这比其他级以上移动，以从堆出来。通过使用艺术画笔（ 如 1厘米宽）删除成年人。 独立蛹轻轻敲锅种子，同时保持锅内的嘴角微微向下，因为蛹倾向于更快地推出对嘴。用画笔去除蛹，在种子盘只剩下幼虫。 PLACE在一个干净的培养皿中分离出幼虫。选择幼虫的适当阶段注射，并将其放置在一个单独的培养皿中。 注：早期末龄幼虫（1-2天的最后幼虫蜕皮后）当分析对成人的形态，以及对变态的RNAi效应常常是合适的。据，但是，有时有必要在倒数第二执行RNA干扰（或更早）阶段来评估早期基因功能（ 例如， 图3E-3H，也可参见克拉克-Hachtel 等人 2013 12）。使用蛹作为大小参照来确定幼虫的龄期。末龄幼虫略长于蛹。备选地，PU-11可用于识别末龄幼虫以及确定末龄幼虫的发展（克拉克-Hachtel 图S4 等人 2013 12）的时间过程。 请将选定的幼虫在培养皿中，直到醚化。将剩下的幼虫和甲虫的其他阶段（如蛹和成虫），回到一个培养瓶用面粉，并返回到孵化器。 6，准备注射针头的将以前拉玻璃针使用上既黏粘或双面胶带显微镜载玻片。使用镊子，测试针拔出，并同时期待通过解剖显微镜才能看到顶端弯曲。稍微抢区朝那里的针弯曲的镊子和扭曲打破了尖端的一面。 保持良好的针头和丢弃等。考虑好针为具有开口，既不太大也不能太小（约0.05mm的直径。 图1A和1B），并成角度以使幼虫角质层容易（ 图1B和图2A-2B）的渗透。考虑一个坏的针是（i）过小，使得双链RNA溶液吸收进针diffi崇拜（步骤7）（ 图1D和2D），（ⅱ）过大时，在注射时引起幼虫损伤和可能的致死率（ 图1C和图2F），（ⅲ）钝，使得角质层困难和增加损伤的渗透。 针插入持针器。 首先，拧下针保持架的前端和放置针的后端插入支架小费。然后，将橡胶垫圈的保持器前端下（至少为1厘米的玻璃针的后端）。 插入针的背面插入支架，用橡胶密封垫完全插入针保持器的开口。螺钉尖端放回支架。 将组装的缝合针夹持器上的针操纵器。保持针保持接近水平的。通过MICR看时调整操纵器的位置，因此，针的末端是位于视图的中心oscope需要。 7，前期投资的双链RNA解进针通过调整与DDH 2 O的浓度和混合用的2倍注射缓冲液（2.3步）等体积的双链RNA溶液制备的双链RNA注射液之前，为了注入。保持在冰上的混合溶液中。看到有关的dsRNA浓度的讨论。 砍20微升一次性吸头的尖端。移取10微升的溶液进入修整枪头。从移液管，同时保持流体在前端通过设置背压小心取出枪头。备选地，小心地取出前端，然后通过使用手指提供压力将溶液到尖端的末端。 将移液管尖端与使用粘性粘性朝向所述针的前端开口部的显微镜载物台的dsRNA的溶液。 翻翻显微镜，缓慢移动装尖向针，直到针尖针只是里面加载的枪头和进入溶液。 同时期待通过显微镜，轻轻一拉回到了注射器的柱塞慢慢地将双链RNA解进针。 注意：不要超载针。作为dsRNA的溶液的末端接近针的前端，慢的拉动速度和停止加载的针的前端之前的溶液将达到空气。如果空气到达前端时，溶液会迅速被吸入针座，从而导致严重的污染问题。针座的详细清洗程序在菲利普和泰2011 11进行说明。 通过打开旋塞除去从注射针筒和针固定器中的压力。然后，从该针的前端移动的移液管尖的路程。从舞台升起针，以防止意外损坏针，同时将幼虫在舞台上。卸下舞台上的走光枪头。 </ol> 8双链RNA注射液将幼虫放入乙醚麻醉篮筐。使用不到10个幼虫，如果学习的技术。使用30-40幼虫在一个回合一次舒服的方法。 把篮子幼虫在乙醚瓶，并盖上盖子。 注：乙醚提出了火灾隐患，也是有害的。执行在通风橱这一步。 醚化幼虫约3分钟。检查幼虫的运动3分钟后。将他们带回了一瓶乙醚另一个30秒，如果他们还在移动。不要醚化时间超过5分钟，因为这可能会增加杀伤力。 注：根据温度和湿度的最佳醚化时间可能会有所不同。 从篮子传送醚化幼虫的玻璃粘滑动的不粘边。使用镊子和同时期待通过显微镜，拿起每一个幼虫逐个把它们拖到幻灯片。把它们放横向和轻轻拍打了他们的身体˚FROM头尾用钳，稍微伸展它们，当您去，以确保它们是固定在载玻片上。 将粘带滑幼虫在显微镜阶段。 将双链RNA装针轻轻放入幼虫的背侧以避免损坏中枢神经系统。此外，还要避免背中线，随着幼虫心脏就设在这里。在这和随后的步骤，请务必使用阶段的幼虫移动（而不是使用针操纵移动针）的针。 注：具体注射部位没有关系的RNAi技术在T。盗似乎是全身性的。然而，它通常是最容易注入到胸部或腹部段的背侧。 将针插入幼虫后，拔出针头稍回，让空间的双链RNA进入幼虫体腔。 轻轻一推就注射针筒，直至幼虫变成绿色（或注射缓冲区的颜色），并期待Štretched饱满。 注：如果学习的技术中，尝试注入尽可能确定的解决方案，它可以被注射到幼虫无显著杀伤力的量。它通常为约0.5-0.7微升。 取下幼虫针。当拆下针，稍微拉回来的注射器，以避免损失的dsRNA（也注意不要拉在空气中）。 注幻灯片上所有的幼虫。请务必删除幼虫未成功注入。完成注射幼虫前醒来（约10分钟）。 从注射显微镜移除与注射的幼虫滑动并离开滑块5分钟以上，直到从乙醚麻醉所有幼虫回收。 用镊子和解剖显微镜下，轻轻地从头上幼虫提升到尾部，从粘性滑动释放他们。放置在一个干净的培养皿中新发布的幼虫。留在培养皿中的幼虫10-15分钟，以允许注射瓦特ound凝结。 将幼虫放置到一个新的瓶用干净的面粉和标签适当地包括菌株名，dsRNA的类型注入浓度的dsRNA，幼虫注射编号和日期。 培养在30℃下注入的幼虫，用70％的湿度。观察幼虫定期的RNAi表型。 注：在7天末龄幼虫化蛹。然后，蛹将E关闭到7天后成虫（如果在定时没有异常引起的RNAi）。 9，确认的击倒和表型分析考虑的RNAi的效率评估由几种不同的分子生物学技术，如定量反转录-PCR（QRT-PCR）和免疫印迹击倒。见Miller 等人2012年7菲利普和泰2011 11进行详细的定量PCR和Western Blot协议，分别为。 分析相关的RNAi表型。 注：相关的RNAi表型可以在几个不同的阶段，不同的培养条件下观察到的，这取决于被靶向的基因。 RNA干扰会影响甲虫形态，变态，生理和行为。通过RNA干扰的频率表型的存在进行检查和在什么条件下的甲虫饲养应针对具体问题正在调查中。