التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق،<em> كونفيوسم كاستانيم</em
Summary
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تقنيات الجينات ضربة قاضية المستندة هي في صميم البحث كونفيوسم. هنا، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في كونفيوسم كاستانيم. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية توفر الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة الظواهر، مما يسمح للباحثين لدراسة وظائف الجينات في سياقات متنوعة.
Abstract
خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، ويوفر ذخيرة من الأدوات التجريبية للدراسات الجينية والتنموية، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل المشروح، نقل الجينات القائم على ينقول، والتدخل الفعال RNA (رني). ومن بين هذه المزايا والتقنيات القائمة على الجينات ضربة قاضية رني هي في صميم البحث كونفيوسم. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة الحياة ببساطة عن طريق حقن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) في تجويف جسم الخنفساء.
في هذا التقرير، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في T. كاستانيم. ويشمل البروتوكول (ط) عزلة المرحلة المناسبة من T. اليرقات كاستانيم للحقن، (ب) تمهيدا لإعداد الحقن، و (iii) حقن الرنا المزدوج الجديلة. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية التي توفر لنا الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة phenotypوفاق، بما في ذلك متعددة الجينات الظواهر ضربة قاضية فضلا عن سلسلة من الظواهر hypomorphic. منذ تقريبا كل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للالرنا المزدوج الجديلة خارج الخلية، وتقنية رني اليرقات تسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة، بما في ذلك الأساس الجيني للاستجابات عضوي للبيئة الخارجية. بالإضافة إلى ذلك، بساطة هذه التقنية تحفز مزيدا من المشاركة الطلابية في مجال البحوث، مما يجعل T. كاستانيم نظام وراثي مثالية للاستخدام في الفصول الدراسية.
Introduction
خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، تكتسب شعبية في مختلف مجالات البيولوجيا ويرجع ذلك جزئيا إلى سهولة أداء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) 1-3. الجينات ضربة قاضية التقنيات المستندة إلى رني تسمح للعلماء لإجراء تحليلات الخسارة من وظيفة دون اللجوء إلى استخدام الأساليب الوراثية المعقدة. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة من خلال حقن بسيطة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) في الخنفساء تجويف الجسم 4-6. ضربة قاضية للجينات متعددة في وقت واحد هي أيضا مجدية في T. كاستانيم عن طريق حقن اثنين أو أكثر من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة في نفس الوقت 7،8. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتولد سلسلة من الظواهر hypomorphic عن طريق الحد من تركيز حقن الرنا المزدوج الجديلة 8. هذه الميزات تجعل التقنيات الوراثية العكسية على أساس رني بدائل جذابة لعلم الوراثة إلى الأمام التقليدية في T. كاستانيم. منذ تقريباكل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للخارج الخلية جزيئات الرنا المزدوج الجديلة 9، وهذا الأسلوب يسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذا التقرير يركز على أداء رني في T. كاستانيم، العديد من الإجراءات الموضحة هنا تنطبق على غيرها من الحشرات. لذلك، هذا البروتوكول هو مفيد لأولئك الذين يرغبون في إجراء تحليلات الخسارة من وظيفة في سياقاتها الاهتمام T. كاستانيم، وكذلك للباحثين الذين يرغبون في تطبيق تقنية رني استنادا إلى الحشرات الأخرى.
حقن الرنا المزدوج الجديلة إلى يرقات يسمح التحليل الوظيفي في مجموعة متنوعة من مراحل حياة الخنفساء، بما في ذلك اليرقات، العذراء، والكبار مراحل 4،5،10. لقد ذكرت سابقا لدينا بروتوكول رني العام اليرقات بما في ذلك إجراءات البيولوجيا الجزيئية 11. في التقرير الحالي، ونحن نركز على وصف الإجراءات حقن الرنا المزدوج الجديلة، والتي هي أفضل وأوضح البصري مع مساعديه. نحن نقدمإجراءات مفصلة خطوة بخطوة حقن فضلا عن أمثلة حقن الجيدة والسيئة. هذا البروتوكول يكمل البصرية البروتوكول السابق، وعند الجمع، وتقديم وجهة نظر أكثر شمولا من الإجراءات رني اليرقات في T. كاستانيم. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش المعلمات لجزيئات الرنا المزدوج الجديلة التي يمكن أن تؤثر على نجاح رني، وتطبيق المقايسات مقرها رني للبحوث الفسيولوجي، فضلا عن تطبيق البروتوكول رني اليرقات في المختبر التدريس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدد من القضايا الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار لضمان نجاح رني، بما في ذلك طول وتركيز جزيئات الرنا المزدوج الجديلة، والمنافسة بين جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة (عند محاولة متعددة نهدم)، وإمكانية خارج الهدف آثار (OTE).
طول الرنا المزدوج الجديلة
طول جزيئات الرنا المزدوج الجديلة يؤثر على كفاءة الاستجابة النظامية رني، مع الرنا المزدوج الجديلة أطول كونها أكثر كفاءة لتحريك رني 7،14،15 (على الرغم من أن الحد أطول من الرنا المزدوج الجديلة غير معروف حاليا). طول الرنا المزدوج الجديلة يجب أن يكون أطول من 50 نقطة للحث على فعالية رني في T. كاستانيم 7. الرنا المزدوج الجديلة بين 150 نقطة أساس و 500 نقطة أساس على ما يبدو مثاليا للتجارب رني. على الرغم من أن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة أطول يمكن أن تستخدم أيضا، سيكون لديهم فرصة زيادة OTE وخطوة استنساخ الجين سوف يصبح من الصعب على نحو متزايد.
الرنا المزدوج الجديلة تركيز
ve_content "> درجات مختلفة من ضربة قاضية الجينات يمكن أن يتحقق اعتمادا على تركيز الرنا المزدوج الجديلة. 1 ميكروغرام / ميكرولتر يبدو أن تركيز انطلاق معقولة، والتي غالبا ما تنتج النمط الظاهري شبه فارغة (قد تختلف اعتمادا على الجينات (ق) من الفائدة ). رني لا يمكن أن يؤديها مع تركيز أعلى (على سبيل المثال، 7-8 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على النمط الظاهري رني أقوى. رني مع التخفيف التسلسلي الرنا المزدوج الجديلة يمكن أن تكون أحيانا مفيدة لإنتاج سلسلة من الظواهر hypomorphic (التكميلي بيانات توموياسو وآخرون 2009 8، وبوراس-كاستلز بيانات غير منشورة).رني المنافسة
ضربة قاضية متعددة الجينات يمكن أن يتحقق في T. كاستانيم عن طريق حقن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة عدة مختلفة في نفس الوقت. ومع ذلك، فمن المعروف أيضا أن وجود عدة جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة موجودة داخل الكائن الحي غالبا ما يؤدي إلى المنافسة بين dsRNAs للوصول إلى مكونات رني <sتصل> 7،14. من المهم استخدام نفس الطول ونفس التركيز لجميع الرنا المزدوج الجديلة عند محاولة متعددة الجينات لتجنب ضربة قاضية الرنا المزدوج الجديلة واحد خارج المنافسة الآخرين (على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة لإجراء مزيد من التعديلات على طول الرنا المزدوج الجديلة والتركيز عند مستويات التعبير تختلف بشكل كبير بين الجينات المستهدفة). نحن، فضلا عن غيرهم، أجرت بنجاح ضربة قاضية مزدوجة وثلاثية (على سبيل المثال، توموياسو وآخرون 2005 16، توموياسو وآخرون 2009 17، ويانغ وآخرون 2009 18). على الرغم من ذلك ممكنا، الرباعي رني (أو أكثر) قد تكون صعبة، لأنه من المحتمل أن يسبب انخفاض كبير في كفاءة رني لجميع الجينات الأربعة المستهدفة.
حالا تستهدف
OTE هو القلق المتأصل للنهج القائم رني. طريقة واحدة للحد من OTE في تحديد المناطق المستهدفة في الجينات التي تشترك تسلسل مماثلة مع جينات أخرى وتجنب هذه المناطق عند تصميم الرنا المزدوج الجديلة. تحليل بسيط BLAST ضد T. كاستانيم توقع مجموعة الجينات يمكن التعرف على هذه المناطق. العديد من الأدوات على الانترنت تسمح أيضا تقييم OTE المحتملين (مثل E-رني 19). أداء رني لمنطقتين غير متداخلة من الجين المستهدف هو وسيلة سهلة وفعالة للقضاء على احتمال تلك التي لوحظت هي سبب الظواهر التي OTE. يتم التقليل من إمكانية OTE إذا رني لمنطقتين غير متداخلة تنتج نفس الظواهر (ما لم تشترك في المنطقتين غير متداخلة تسلسل مماثل).
تقييم الجينات ضربة قاضية بوسائل غير المظهرية يحلل غالبا ما يكون حاسما في البيانات المتعلقة رني الحالية بشكل فعال. بطريقتين رئيسيتين لتقييم ضربة قاضية الجينات هي QRT-PCR وتحليل لطخة الغربي. QRT-PCR هو وسيلة مريحة لقياس مستوى مرنا الهدف، واستخدمت في العديد من الدراسات المتعلقة رني بما في ذلك تلك الموجودة في T. كاستانيم (انظر ميلر وآخرون 2012 7 على سبيل المثال). Howevإيه، ويجب اتخاذ الحذر، كما رأينا مؤخرا بعض الحالات التي يكون فيها مستوى مرنا الهدف بواسطة رني التنظيم حتى (على الرغم من أن المنتج هو بروتين ينظم أسفل) (بوراس-كاستلز بيانات غير منشورة). ومن غير المعروف حاليا ما إذا كان هذا مرنا رني الناجم عن التنظيم يمكن أن يكون واسع النطاق أو فريدة من نوعها لجينات معينة. تحليل لطخة الغربي هو طريقة أخرى لتأكيد ضربة قاضية الجين. هذه الطريقة غير موثوق بها تماما كما أنه يقيس كمية من البروتين المنتج النهائي. اشتراط وجود الأجسام المضادة المحددة ضد البروتين المنتج من الجين المستهدف هو الجانب السلبي لهذا النهج. وباستخدام قياسات مستقلة متعددة بالإضافة إلى تحليل المظهري زيادة ثقة البيانات المظهرية التي حصل عليها التحليل القائم رني.
منذ بدايته في T. كاستانيم، وقد استخدمت في المقام الأول رني لدراسة وظيفة الجين في التنمية وتشكيل نمط. هذه T. وكانت دراسات التنموية كاستانيم ناجحة للغاية في characterizing الوظائف المحفوظة تطويريا وتباعدت من الجينات (مراجعة في دينيل 2008 1 وKlingler و2004 2). دراسات ومع ذلك، استنادا رني في T. كاستانيم لا تقتصر على البيولوجيا التطورية. على سبيل المثال، رني يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجين في مجموعة واسعة من الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، بما في ذلك التسامح الإجهاد، والافتراس والعدوان، واختيار رفيقة، وأنماط النشاط، وآليات الدفاع.
واحد صعوبة تطبيق رني إلى هذه السياقات هي احتمالات الآثار عديد المظاهر. في كثير من الأحيان، فإن جينات الفائدة لديها مجموعة متنوعة من الأدوار في جميع أنحاء T. كاستانيم دورة الحياة، مما يجعل إزالة الجينات من دون آثار المظهري غير مقصودة الصعبة. ومع ذلك، فإن القدرة على أداء بسهولة رني في مجموعة متنوعة من المراحل يمكن أن يكون في كثير من الأحيان استراتيجية فعالة لتجنب هذه الآثار عديد المظاهر. على سبيل المثال، وأداء رني في البالغين بدلا من اليرقات أو العذارى قد تسمح لنا بالتغلب على عزيزمالت الفتك الناجمة عن ضربة قاضية الجين خلال النمو المبكر. المرونة للاستجابة رني في T. كاستانيم مما يجعل هذا الطراز خيارا جذابا للتكيف رني إلى تجارب من وظيفة الجين في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية.
ت. نظام كاستانيم هو أيضا مثالية للاستخدام في مختبر التدريس. T. كاستانيم يمكن تربيتها بسهولة على الدقيق / خليط الخميرة في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) دون subculturing المتكرر، وتقنيات رني في T. كاستانيم بسيطة بما فيه الكفاية لأن تتكيف مع مختبر مع الشباب والعلماء التعلم. كما رني أصبح تقنية أساسية في مجموعة متنوعة من المجالات البيولوجية، فمن الأهمية بمكان أن يتعرض الطلاب لهذه التقنية. طبيعة مستقيم الى الامام لتقنية رني اليرقات في T. يشجع كاستانيم أيضا المزيد من الطلاب للمشاركة في البحوث، مما يجعل T. كاستانيم مرشح رئيس لالفصول الدراسية الموجهة للنظام وراثي. </ P>
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز المعلوماتية الحيوية وعلم الجينوم وظيفية (CBFG) في جامعة ميامي للدعم التقني. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ميامي منحة بدء (YT)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (YT: IOS 0950964).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
| 6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
| Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
| Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
| 1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
| Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
| Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
| Plastic CD case | Amazon | ||
| Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
| Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
| Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
| Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
| Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
| Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
| Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
| Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
| Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
| Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
| X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
| X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
| Manipulator | Narishige | M-152 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
| 30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
| Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
| art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |
References
- Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Génétique. 180, 1779-1786 (2008).
- Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
- Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
- Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
- Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. . Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).
