인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
수리 및 골격 근육의 재생은 상주 근육 줄기 세포 인 위성 세포의 작용을 필요로한다. 이러한 문화에서 공부 인간의 근육 생검 소화 효소를 사용하여 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 할 수 있습니다. 정량적으로, 소화 효소에 의한 두 가지 점착성 세포 유형이있다 : (ⅰ) 위성 CD56 +로서 처음 확인 된 세포 (이라, 근원 세포 또는 근육 전구체 세포), 및 나중에 CD56 + / 최근 desmin + 세포와 같은 (II) muscle- 과 TE-7 + – CD56으로 식별 파생 섬유 아세포. 섬유 아세포 문화에 매우 효율적으로 증식 및 혼합 세포 집단에서 이러한 세포는 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 따라서 배양 중 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 여기에서 우리는 DESCR모두 고순도 (> 95 %, 근원 세포)과 좋은 수율 (~을주는 콜라겐을 사용하여 세포의 부드러운 소화 효소에 따라 정렬 및 자기 활성화 된 셀 정렬 (MACS) 다음 디스 파제의 시스템을 IBE 2.8 × 10 6 ± 8.87 문화 실험에 대한 시험 관내 7 일) 후 × 10 5 세포 / g 조직. 이 방법은 CD56에 대한 항체에 접합 된 마이크로 비드, 자기 비드와 혼합 된 근육 유래 세포 집단을 배양하고 자기장 비록 세포 전달에 기초한다. 마이크로 비드에 결합 된 CD56 + 세포는 CD56 반면 필드에 의해 유지됩니다 – 세포는 칼럼을 통해 방해받지 않고 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액을 도금하여 배양 할 수있다. 주어진 개입, 세포 형태 및 식 핵 전사 인자를 포함한 단백질의 위치 파악을 수행하면 특정 항체 및 화상 (p)과 면역 형광 표지를 사용하여 정량화 할 수있다세 싱 및 분석 패키지.
Introduction
골격근의 수선과 재생은 위성 셀 1, 근육 조직 줄기 세포 2,3-.의 작업이 필요한 생체 이들 세포는 모든 myofibre의 sarcolemma 및 기저판 사이에 가역적으로 정지 상태로 존재하지만, 증식 활성화 될, 퓨즈 및 근육 조직으로 분화가 손상 수리 (3)를 다시 생성됩니다. 위성 세포는 소화 효소 (4)를 사용하는 젊은 노인 인간의 근육 생검 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 될 수는 이후 차 문화 (5)에서 공부하실 수 있습니다. 세포 집단 모두 수율 및 순도에 따른 본 분리 공정의 효율은 사용 된 방법에 따라 샘플들과 다를 수있다. 소화 효소에 의한 두 가지 종류의 세포 부착은 CD56 + / 최근 desmin 세포, 및 MU 당초 식별 위성 세포 (이제 지칭 근원 성 근육 세포 또는 전구 세포), 아르scle 유래 CD56으로 식별 섬유 아세포, – 그리고 TE7 + 셀 (5). 섬유 아 세포는 빠른 증식 속도를 가지고 있으며, 근원 세포와 같은 세포 – 세포 접촉시 돌이킬 수없는 성장 정지 및 터미널 차별화를받지 않는다 따라서 혼합 된 인구에, 섬유 아세포 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다.
섬유 아세포는 종종 있지만, 자신의 권리 연구의 가치 세포와 같은 섬유 아세포에 대한 관심은 그들이 근육 수리 (6) 동안 근육 조직 세포와 협력 역할을하는 것으로 나타났다 특히로서, 지금이, 근육 생물학에 대한 자극으로 간주되어왔다 . 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 배양 따라서 두 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 세포를 추후 연구 정렬 할 수있는 방법 및 / 또는 계산 및분석 하였다. FACS 확실 인간 근원 성 세포를 풍부하게 도시되었지만, 후속 배양을위한 세포의 수율이 높은 7 지금까지 없었다. 이러한 노화 4와 관련된 위성 세포 유래 근육 조직 세포와 매우 가난한 증식과 분화와 같은 체세포의 제한된 복제 가능성을 감안할 때, 더 부드러운 접근이 필요하다. 단일 근육 섬유의 문화는 또 다른, 덜 공격적, 자신의 sublaminal 틈새와 문화 8,9에서의 활성화 후 여전히 상주 쥐의 위성 세포를 얻는 수단 제공합니다. 그러나,이 기술은 인간의 근육 유래 세포 연구에 관심이 많은 연구소에 액세스 할 수 없습니다 것을 의미한다 (섬유가 거의 건에 건에서 얻을 수 없으므로) 인간의 근육 생검 재료에서 가능하지 않은 경우가 종종있다. 또한, 단일 섬유 기술은 매우 제한된 세포 수를 제공합니다.
여기에서 우리는 세대에 따라 정렬 시스템을 설명TLE 효소 콜라게나 제를 사용하여 세포의 소화는 자기 활성화 된 셀의 두 개의 연속 라운드 분류 고순도 (> 95 %, 근원 세포) 및 수율 (~를 모두 제공 (MACS) 다음 디스 파제 2.8 × 10 6 ± 8.87 × 10 5 세포 / 문화 실험 g 조직). CD56은 동일계 10 및 11에서 인간 체외 위성 세포의 식별을위한 표준 금 표면 마커 간주 비드 부착 이상적인 표면 마커 후보를 제공한다. 이 방법에서는 CD56 항체는 산화철 및 폴리 사카 라이드 – 함유 상자성 비드 강한 자계 (12, 13)에 배치 된 고 구배 자기 세포 분리 컬럼을 통해 세포에 결합 및 통과에 접합된다. 분리 컬럼은 강한 자계 구배 (~ 4tesla)을 생성하는 그 표면을 향해 자력선을 집중시키는 역할을 강자성 스틸 울 또는 철 분야의 행렬로 채워진다 14. 이 컬럼에서 조금이라도 자기 세포는 매력과 표면 (14)에 흡착. 언 바운드 (CD56 -) 자기 마이크로 비드으로 표시 CD56 + 세포가 자기장 12,15에서 제거 될 때까지 유지되는 반면 세포는 칼럼을 통해 전달합니다.
선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액은 상기 실험을 위해서, 원하는 밀도로 도금 될 수있다. 세포 성분은 면역 세포 화학을 사용하여 식별 될 수 주어진 개입 이어 넓은 필드 또는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 묘화하고 주어진 이미지의 모든 표지화 된 세포의 신속한 대물 측정이 가능 화상 해석 방법을 이용하여 정량적으로 분석 하였다. 근육 조직 세포 반면, 인간의 섬유 아세포가 쉽게 지방 세포에 transdifferentiate – 우리의 실험실에서 우리는 CD56을 설명하기 위해 영상 분석 (16) 다음이 이중 면역 자기 정렬 방식을 사용했다위성 기원의이 지방 세포 변환 5 뛰어납니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 근육 생검 재료의 작은 샘플에서 인간의 근육 유래 전구 물질의 선택적 농축에 대한 immunomagentic 정렬 절차를 설명했다. 이 기술은 섬유 아세포에 인간의 근육에서 파생 된 문화의 손실을 극복하기 위해 우리 실험실에서 매우 귀중뿐만 아니라 근육 유래 전구 세포의 고유 한 인구의 독특한 행동을 이해했다. 일단 정제 된 근육 조직 세포는 단백질 및 / 또는 유전자 발현의 변화를 조사 또는 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
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