Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise "Mapeamento Cargo"

Transporte intracelular é crucial em todos os tipos de células para a administração de proteínas, membranas, organelos, e moléculas de sinalização celulares a vários domínios ^1. Os neurônios são células altamente especializadas, com, projeções polarizadas longos que criticamente dependem do transporte intracelular de cargas essenciais para a sua entrega de longa distância para várias microdomínios axonal. Este transporte é mediado por kinesins e dyneins – duas grandes famílias de proteínas motoras moleculares – que se ligam às cargas e acompanhar ao longo dos microtúbulos polarizados em anterógrada e retrógrada direções, respectivamente. Enquanto movimento retrógrado é mediada principalmente por dineína, o movimento na direcção anterógrada é facilitada por uma grande família, funcionalmente diversificada de motores de cinesina. Consequentemente, o transporte de cargas axonal anterógrado poderia ser mediada por vários membros da família do kinesin superfamília ^1-5. Apesar de algumas cargas mover persistentemente em qualquer direção, mcargas ost mover bidirecionalmente e reverter freqüentemente em seu caminho para seus destinos finais ^1,5-13. Além disso, demonstrou-se que os motores de direccionalidade associado opostas simultaneamente às cargas, levantando a questão sobre a forma como o movimento regulado de cargas é coordenado por motores de polaridade oposta ^5-7. Juntos, o transporte de cargas axonais é um processo concertada que é regulada pela composição dos motores e das suas actividades bioquímicas específicas, que por sua vez são dependentes de vários adaptadores e parceiros de ligação de regulação ^14.

Para descrever fielmente o mecanismo de transporte axonal para uma carga específica e para descobrir a regulação subjacente de que o transporte, é fundamental para determinar a composição de proteínas a motor e seus parceiros de ligação regulamentares associadas com cargas individuais durante o seu transporte de animais vivos. Outros métodos, como por exemplo abordagens bioquímicas, fornecer estimativas de mot médiaou composições sobre as populações heterogêneas vesícula purificados, mas estas estimativas não revelam o tipo ou a quantidade de motores associados ao único vesículas móveis. Além disso, a reconstituição do transporte de vesículas ao longo dos microtúbulos pré-montados in vitro permitiu a medição da quantidade de um tipo de motor em um único nível de vesícula ^15. No entanto, estas experiências não se correlacionam directamente a quantidade de motores eléctricos com as características de transporte dessas vesículas, e medido o transporte, na ausência de factores de regulação celular.

Um protocolo aqui é apresentado, o qual determina a composição do motor (tipo e quantidade relativa de motores), da vesículas que se deslocam individuais a partir de imunofluorescência (IF) de dados de medição endogenamente expressa proteínas do motor, e correlaciona-se esses parâmetros para o transporte directo de exactas as mesmas vesículas em neurónios ^16. Este método implica mapeamento preciso dos dados IF-to-live movimentação de cargas. Isto é conseguido por growing neurónios do hipocampo de rato em dispositivos de microfluidos de acordo com protocolos estabelecidos ^17-19. Estes dispositivos permitem a identificação e correlação ("mapeamento") dos axônios e cargas móveis individuais nas modalidades de microscopia de luz fixa e ao vivo (Figura 1). Neurônios cultivados são transfectadas com proteínas de carga fluorescente etiquetado cujo transporte é fotografada em alta resolução espacial e temporal para obter informações detalhadas movimento que é representada em kymographs. Durante o curso de imagiologia, os neurónios foram fixados com paraformaldeído, e subsequentemente corados com anticorpos contra as proteínas endógenas a motor. De carga e motor imagens fixas são sobrepostos kymographs movimento vivo de "mapa" (colocalize) los para a carga viva movimento trajetórias ^16. Correlacionar o movimento vivo das cargas com a associação de proteínas motoras, co-localização é analisado usando um pacote de software MATLAB custom made chamado de "Motor co-localização ^"16,20. Cargas e motores marcados com fluorescência gerar recursos limitados puntiformes-difração que podem se sobrepõem parcialmente. Para resolver a situação de sobreposição de pontos lacrimais, o primeiro software ajusta automaticamente as funções de Gauss para cada função de dispersão, o que representa puncta fluorescente indivíduo, para determinar a sua posição exacta XY sub-pixel coordena e intensidade amplitudes ^21-23. As posições dos motores e cargas são subsequentemente comparados uns com os outros para determinar colocalização ^16,20. Por conseguinte, este método atribui mais precisamente entre pontos lacrimais colocalização de fluorescência em comparação com outros métodos de ^24.

A robustez do método é a capacidade de avaliar a co-localização dos motores com carga indivíduo em células fixas, para as quais trajectórias de movimento vivos (por exemplo, a direcção em que eles se moviam no momento da fixação) foram recorded. Com este método, cinesinas e dyneins foram encontrados para associar simultaneamente a vesículas que transportam a proteína prião normal (PrP ^C CELULARES), uma carga que se move neuronalmente enriquecido bidireccionalmente ou permanece estacionário em ¹⁶ axónios. Esta análise permitiu a formulação de um modelo de trabalho para a regulamentação da PrP ^C movimento vesícula em que anterógrada (kinesin) e (dineína) motores retrógradas coordenar suas atividades, a fim de mover as vesículas em qualquer direção ou permanecer parado enquanto associada à carga . Outra força deste método é a sua potencial aplicabilidade ampla para a caracterização de uma co-localização / associação de muitas cargas marcadas com fluorescência que se movem em virtualmente qualquer tipo de célula, com qualquer outra proteína (s) de interesse. Assim, a correlação vivo / fixo poderia potencialmente permitir a detecção de interacções proteína-transientes de carga, como muitos fluorescentemente marcado indivíduo partículas em movimento pode ser analisado ao longo de um p desejareríodo de tempo. Dada a aplicabilidade ampla e do tipo de questões que este método pode resolver, este protocolo vai ser de interesse para um grande público de biólogos celulares, incluindo aqueles que estudam o tráfico eo transporte em neurônios ou em outros tipos de células.