طرق الخلية المرفقة قياسات السعة في ماوس الكظرية أليف الكروم خلية
Summary
After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.
Abstract
Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.
Introduction
وتوسط انتقال متشابك بواسطة إيماس من الحويصلات التي تحتوي على ناقل عصبي متشابك، ويجب أن تخضع هذه الحويصلات إعادة التدوير التقامي المحلي داخل محطة العصبية للحفاظ على الاتصالات العصبية على المدى الطويل. نظرا للدور أساسي في انتقال متشابك في الدماغ، وفهم الآليات الجزيئية التي تشكل دورة حويصلة متشابك هي الركيزة الأساسية نحو فهم أفضل في مجال الاتصالات الخلوية ككل. بين النظم نموذج خلية، وقد وفرت الخلية أليفة الكروم الكظرية بعض البصيرة الأكثر حسما في الآلية الجزيئية الكامنة وراء إعادة تدوير حويصلة متشابك. إيماس، فإن الخطوة النهائية في إطلاق الناقلات العصبيه، وقد درس كثيرا وفحصها من خلال استخدام الخلايا أليفة الكروم الكظرية 1،2. في الواقع، معظم اللاعبين الجزيئية التي تنسق تشكيل والاستهداف والالتحام والانصهار من حبيبات إفرازية تم تحديدها نظرا لتطبيق شعبةتقنيات في الخلايا أليفة الكروم ERSE 1. وعلاوة على ذلك، من خلال توفير فرصة للسماح للقرار حويصلة واحدة من الآلات البروتين المشاركة في إيماس، تبقى الخلايا أليفة الكروم نموذجا قويا لمعالجة مسائل الانصهار الحويصلة 3.
واستخدمت قياسات السعة الخلية المرفقة أولا في حل واحدة الانصهار الحويصلة خلال إيماس 3. إيماس حويصلات صغيرة مثل ~ أثبتت 60 نانومتر في القطر ليتم الكشف عنها بواسطة القياسات قبول غشاء الخلية مع تقنية المشبك التصحيح في الخلية المرفقة التكوين 4-7. ويعرف قبول كمقياس لمدى سهولة الدائرة أو الجهاز سوف تسمح لتدفق الحالية. هو معكوس مقاومة. وبالتالي، توفر قياسات قبول فهم السعة الغشاء. ويتم إنجاز هذا عن طريق دمج الغشاء الحويصلي في غشاء البلازما. هذا التأسيس يكشف عن تغيرات في سطحمنطقة 8. تسبب كل حويصلة التفجير زيادة تدريجية في السعة غشاء 9،10. بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا القياس القبول في تصرف الغشاء والمسام الانصهار تصرف خلال هذا الحدث exocytotic 3. كما وفرت هذه التقنية أداة فريدة من نوعها في تحديد حركية حويصلة واحدة خلال إيماس، مختبرنا وقد طبقت مؤخرا هذا المفهوم للكشف عن الإلتقام من الحويصلات واحدة 11،12.
مصلحتنا هي محددة بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME)، والتي تم اعتبارها مكونا أساسيا في التدبير المنزلي العديد من الخلايا 13 و كمسار الرئيسي لحويصلة متشابك الإلتقام في المحطات العصبية 14،15. ومن المعروف CME إلى أن تكون مهمة من الناحية البيولوجية، ومع ذلك، لا تزال حركية ليست مفهومة بشكل جيد بسبب القيود التقنية في رصد الأحداث التقامي المفرد. نظرا لأوجه التشابه في آليات exocytic بين الخلايا أليفة الكروم والخلايا العصبية 1، فمن ررausible التي قد تطبق آليات انشطار الخلايا أليفة الكروم في الأرجح إلى حويصلة متشابك الإلتقام في الخلايا العصبية. وقد استخدمت قياسات السعة الخلية المرفقة لرصد الأحداث التقامي الفردية وتحليل حركية الانشطار، والتي معظم الطرق غير قادرة على حلها. في منطقتنا التسجيلات الخلية المرفقة، وفرضه موجة جيبية عند 20 كيلو هرتز حول احتمالات عقد، ويتم فصل الانتاج الحالي في غشاء تصرف في قناة واحدة وغشاء السعة في قناة أخرى من مرحلتين قفل في مكبر للصوت 16- 18. من تغيرات في غشاء تصرف والسعة، يمكن للمرء حساب حركية الانشطار المسام، والتي تتطابق المرجح أن الرقبة غشاء أنبوبي الذي يربط حويصلة استيعاب لغشاء البلازما قبل حويصلة قرصة حالا. جماعي، هذه التقنية تتيح لنا الفرصة لدراسة الآليات التنظيمية للحويصلة الانشطار خلال التعليم الطبي المستمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياسات السعة الخلية المرفقة تتطلب عدة خطوات حاسمة من أجل الحصول على التسجيلات ذات الجودة العالية بنجاح: 1) خلايا قابلة للحياة وصحية أعدت من الغدد الكظرية. 2) PDL طلاء لل coverslips. 3) تشكيل ختم gigaohm. 4) مستوى الضوضاء النظام؛ و 5) مرحلة التصحيح.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100mL |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter-1.5 mm |
| Inner diameter 1.10 mm | |||
| Length- 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P. Cell biology of the presynaptic terminal. Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
