神経病原の非侵襲的モデル<em>エシェリヒア·コリ</em>新生ラットにおける感染

この研究で行われたすべての動物実験は、国内および欧州の法律に準拠し、薬局のUCL学校の倫理委員会と英国内務省（HO）によって承認された。 HOプロジェクトで行ったすべての動物の仕事はPPL 2243分の80とPPL 7773分の70をライセンス供与しています。 1.ラットの準備病原体フリーのWistar新生児ラットを使用して、すべてのin vivo実験を行う。 21℃、45 – – 55％湿度、15から20のエア変更/ hrで、最適な条件（19条、 – （11週齢の雌9）彼らの授乳中の母親と個々のケージ内のすべてのラットの仔（コロニーあたり12新生児）を保持12時間の明/暗サイクル）。 2.細菌細胞調製ストアE. 20％ 大腸菌 K1株-80℃で（v / v）グリセロール。各実験について、寒天プレートミューラーヒントン（MH）への株式細菌をプレートアウトし、37℃、CO / Nでインキュベートする。 給餌、inocu前日シングルE.付きMHブロスの後期10ミリリットル37℃、200rpmで大腸菌 K1、コロニーや文化、O / N。培地の汚染のための対照として、未接種MHブロスを10ml調製し、200rpmで37℃でインキュベートする。 転送MHブロス9.9mlの中にO / Nの細菌懸濁液100μl（1：100 v / v）であり、中間指数相が0.6の光学密度に対応し、到達するまで、37℃、200rpmでインキュベート600nmで（OD 600）の波長で測定した。 E.と新生ラットの3摂食大腸菌 K1はそっと口を開くことができ、首筋から片手で垂直に動物を保持する。ゆっくりと30秒の期間にわたって動物の口に接種物（〜37℃）の20μLを動物の口に滅菌ピペットチップを挿入し、ピペット。すぐに給餌した後、その母親に動物を返します。 8×10 6細菌トンを与えてきた- 4がいることを確認しますOシリアルPBS​​中接種物の希釈およびMH寒天プレート上にスポッティングすることにより、それぞれの子犬。 E.による植民4.アセスメント大腸菌 K1は優しく首筋から片手で動物を保​​持します。無菌PBS中の滅菌綿棒を湿らせ、その後、静かに肛門周囲の領域を綿棒。すぐに拭き取り後に母親に動物を返します。 滅菌PBS300μlの入ったチューブにスワブ先端を置き、氷上で保存する。 PBS中で連続希釈により生菌数を測定し、マッコンキー寒天プレート上にプレーティング。 実行可能なE.を決定バクテリオファージ感受性試験によって大腸菌 K1は。滅菌微生物学的ループを使用して個々のコロニーを採取し、ボルテックス混合を受けた後、滅菌PBSを200μlに浸漬。 直線でMH寒天上に滅菌微生物学的ループ、サブカルチャーを使って。プレートを30秒間乾燥することができ、その後、BAC10μlのピペット線の中心へteriophageのK1E（10 9プラーク形成単位/ ml（PFU / ml）で）。 37℃でプレートO / Nインキュベートする。 翌日、バクテリオファージ媒介性溶解用のプレートを調べます。 疾患重症度の5評価 表1に概説7点スコアリングシステムを用いて5回、毎日4 -各動物の疾病の重症度を評価する。 動物のスコアは7の外≥3場合は、すぐに苦痛を最小限にするために動物を間引く。死んだ動物を記録します。 新生ラットと採血6.安楽死優しく頭頸部を露出させ、片手で動物を保​​持します。アルコール綿棒で拭いて動物の首を消毒。微量のエタノールを除去し、滅菌PBSでリンスする前に、70％エタノールを用いて、はさみの大きなペアを消毒する。 優しくペトリ皿の真上に動物を開催しています。シャープsurgiを使用して新生児を斬首血液がペトリ皿に滴下することを確実にするCALはさみ、。皮膚細菌叢と血液の汚染を防ぐためにヘッドとの接触を避けてください。 直ちに滅菌ピペットを用いて血液を採取し、20の濃度のヘパリンナトリウム塩と混合 – 0.5ミリリットル微小遠心管中で50単位/ ml。 PBS中で連続希釈により生菌数を測定し、マッコンキー寒天プレート上にプレーティング。実行可能なEの数を決定バクテリオファージK1Eに生菌の感受性を試験することによって大腸菌 K1は。 7.解剖新生ラットの断頭に続いて、目的の組織を切除し、収集するために無菌状態を使用しています。 70％エタノール及び滅菌PBS中（ 図1に示されている）すべての機器を洗浄する。 解剖ボードを清掃し、70％エタノールで完全に腹部を濡らす。左後脚へのピン止め、その裏に死体を置き、（i）で解剖ボードに固定する無菌の針で動作テーブル、（ⅱ）死体をストレッチし、操作テーブルに右前脚を固定する、（ⅲ）操作テーブルに右後肢と左前肢をピン止めする。 小さな解剖ハサミを使用して、胸骨に下腹部から死体の左側に沿って切断した後、ピンセットを用いて下腹部の左側に沿って皮膚を引っ張る。 胸骨を横断切除を拡張した後、下にある構造のいずれも損傷していないことを保証する鉗子と小さな解剖ハサミを使用して、下腹部に胸骨から死体の右側、ダウン。 最後に、優しく腹膜を露出するようにアイリスに湾曲した解剖鉗子を用いて下腹部に胸骨から皮膚弁をプルダウン。 根底にある臓器のいずれも損傷していないことを保証し、優しく鉗子で腹膜を高め、内臓が露出するように垂直に切断。 8.収集消化管胃、小腸、盲腸、結腸および腸間膜リンパ系を識別します。 優しくいずれかの側で離断によって胃を削除し、その後、滅菌ピンセットを用いて滅菌PBS 1.6 mlを含むビジューに入れる。 直腸でコロンを横断する。慎重に滅菌ペトリ皿に解剖鉗子と場所を使って死体から全体の腸質量を引く。腸の構造および腸間膜リンパ管構造が分離しないように、これは静かに行われていることを確認します。 消化管および腸間膜リンパ系の9の分離（図2） 胃腸管が完全に浸漬されている保証ペトリ皿に無菌PBS 30ml中に注ぐ。 腸間膜リンパ系の中央質量を特定し、細かい解剖鉗子を用いてピンチ。小腸の最も近位の部分を特定し、細かい解剖鉗子を用いてピンチ。 ゆっくりセントラを引っ張る腸間膜リンパ系および2つの組織まで、反対方向に遠位小腸のLの質量が完全に分離されている。これは、近位、中間および遠位の領域の再現性のあるコレクションを妨げるとして、小腸が引き伸ばされていないことを保証するために注意して、このプロセスを実行します。 300に腸間膜リンパ系を配置 – 滅菌PBS500μlを、氷上に置きます。 GI管の10セクショニング結腸から小腸を分離するために盲腸で胃腸管を横断する。 300にコロンを置き – 500μlの滅菌PBS、氷上に置きます。 近位、中間および小腸の末端領域からの代表組織を収集しています。中間点から小腸を合わせます。 次に、（i）は遠位小腸などの盲腸に先立って組織の最後の2センチメートルを収集、（ⅱ）5からの組織を収集 – 近位小腸などの中間点上記の7センチ、そして真ん中小腸などの中間点より5センチ – （iii）の3から組織を収集します。 11.肝臓の収集胃を除去した後のラットの肝臓の3ローブを識別します。 細かい解剖鉗子を用いて腹腔からローブを引き離す。 細かいハサミを使用して任意の添付靭帯を切断することによって肝臓を削除します。氷上で500μlの滅菌PBSと場所 – 300肝臓を置きます。 12.脾臓の収集脾臓を識別します。 離れて胃から脾臓を引き、gastrosplenic靭帯をカットする微細なハサミを使用しています。 氷上で500μlの滅菌PBSと場所 – 300に脾臓を置きます。 13.腎臓の収集消化管および他の器官の除去時に腹腔の奥に見えるようになります腎臓を特定します。 カット尿管および任意の添付靭帯のu細かい解剖ハサミを歌い、細かい鉗子を用いて腎臓を取り除く。副腎と細かい鉗子や解剖ハサミを使用して（まだ接続されている場合）は、任意の脂肪物質を取り除きます。 300-500μlの滅菌PBS中に両方の腎臓を置き、氷上に置きます。 14.脳の収集断頭後、湾曲した鉗子を用いて直立した状態で頭部を保持します。縦方向に湾曲した鉗子の別のセットを使用して、頭の上に皮膚をつまみ、細かい解剖ハサミを使用して切開する。細かい解剖ハサミで縦方向に再び、首の近くに残りの皮膚をカット。 頭蓋骨を明らかにし、細かい解剖ハサミを用いて皮膚フラップを除去するために両側に細かい鉗子を用いて外向きの方向に皮膚を引っ張る。脊髄開口部に微細な解剖ハサミを置き、演壇に向かって頭蓋骨に沿って切開する。 細かい鉗子を用いて外向きの方向に頭蓋骨の両方のセクションを引き出します。頭蓋骨セグメントを削除するカット。 <li>は演壇に向かって脊髄開口部から上向きにすくいモーションを使用して、広範な鉗子を用いて脳を削除します。断頭手順から任意の血液を除去するためにPBS中で2回の脳を洗ってください。 15.組織の処理および均質化滅菌PBSを含有する管に生存カウントまたはDNA抽出、場所の組織を必要とする実験のために。すぐに短期的には20％のグリセロールを-20℃で連続PBS中に希釈し、マッコンキー寒天培地プレートにプレーティング、または店舗により生菌数を測定。 DNA抽出、-20℃で保存組織のために。 RNA抽出、RNAlaterで液の適切なボリュームに場所組織（1 mgの組織あたり10μl）を必要とする実験のために、その後、短期または-80℃長期貯蔵で-20℃で直ちに保存してください。 イメージングを必要とする実験のために、場所次に10ミリリットルMethacarn溶液（60％メタノール、30％クロロホルム、10％酢酸）中で組織を保存するtはRT（20から25°C）まで3週間。 組織の添加前後の管の重量を比較することによって組織重量を計算する。ホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズする。各サンプルの均質化の間に滅菌PBSで一度70％エタノールで二回ホモジナイザーを洗ってください。 注：Methacarnの固定は、ムチン関連の粘膜防御構造を維持するために、腸の試料の固定のために望ましい。ホルマリン固定組織は、全身に使用することができる。