Neuropathogenic的非侵入型<em>大肠杆菌</em>感染乳鼠

在这项研究中进行的所有动物实验符合国家和欧洲立法和批准了药剂的UCL学院和伦理委员会的英国内政部（HO）。在何项目进行的所有动物上岗证PPL二千二百四十三分之八十〇和PPL七千七百七十三分之七十〇。 1.鼠准备开展所有在体内使用无病原体的Wistar新生大鼠的实验。 保留所有的鼠窝（每个群体12例新生儿）在单独的笼子与哺乳期的母亲（9 – 10周龄雌性），在最佳条件（19岁 – 21°C，45 – 55％的湿度，15 – 20换气/小时12小时光照/黑暗周期）。 2.细菌细胞的制备商店E.大肠杆菌 K1的库存量的20％（体积/体积）甘油在-80℃下。对于每个实验，板材缺货细菌到穆勒，寒春（MH）琼脂平板上，并在37°CO / N。 喂奶前，inocu一天迟10毫升MH肉汤与单个大肠杆菌大肠杆菌 K1的殖民地，文化O / N在37℃，200转。作为介质污染的控制，制备10毫升未接种MH肉汤的孵育在37℃下以200rpm。 转移100μl的O / N的细菌悬浮液的进9.9 MH肉汤中的溶液（1：100的体积/体积），并孵育在37℃，200rpm下，直到指数中期阶段达到时，对应于0.6的光学密度在600nm（OD 600）的波长进行测定。 3.喂养新生鼠的E.大肠杆菌 K1 轻轻地从颈背垂直放置在一只手的动物，允许嘴巴得以打开。慢慢插入无菌移液管尖端插入动物的嘴，以及移液管将20μl接种物（〜37℃）到动物的口，在30秒的时间周期。喂奶后立即返回了动物母亲。 验证4 – 8×10 6细菌已被送入吨o分别小狗通过连续稀释在PBS中的接种物，并点样到MH琼脂平板上。 由E. 4.评估殖民化大肠杆菌 K1 轻轻地从颈背握住动物在一只手中。浸湿无菌棉签在无菌PBS，然后轻轻擦拭肛周区域。擦拭后立即返回动物的母亲。 将拭子末端到含有300微升无菌PBS的管并储存在冰上。 通过在PBS中的系列稀释确定的存活细菌的数量和电镀到麦康凯琼脂平板上。 确定可行的E.大肠杆菌 K1由噬菌体药敏试验。挑选使用无菌微生物环状单菌落，浸入200微升无菌PBS，然后进行涡旋混合。 在一条直线上用无菌微生物环状物，亚培养至MH琼脂上。让板干燥30秒，然后吸取10微升脊梁的teriophage K1E（10 9噬斑形成单位/ ml（PFU / ml）的）上线的中心。孵育板O / N在37℃。 第二天，检查板噬菌体介导的裂解。 疾病严重程度的评估5 使用表1中所列的7分制每日5次-评估各动物4的疾病的严重程度。 如果动物分数≥3出7，立即宰杀的动物，以减少痛苦。记录动物的死亡。 6.安乐死新生大鼠和采血车轻轻握住动物在一方面，露出的头部和颈部。用酒精棉签擦拭消毒动物的脖子上。消毒大对使用70％的乙醇剪刀，清洗无菌PBS去除微量乙醇之前。 轻轻直接持有的上述动物的皮氏培养皿。杀头使用锋利的surgi新生儿卡尔剪刀，确保血液滴入培养皿。避免与磁头，以防止血液污染皮肤菌群接触。 立即使用无菌移液管收集血液，并与肝素的钠盐混合，在20的浓度 – 在0.5 ml离心管50单位/ ml。 通过在PBS中的系列稀释确定的存活细菌的数量和电镀到麦康凯琼脂平板上。确定可行的大肠杆菌的数量大肠杆菌 K1通过检测活细菌的敏感性噬菌体K1E。 7.解剖继新生大鼠断头，用无菌条件下切除和收集感兴趣的组织。洗在70％乙醇和无菌PBS中的所有仪器（ 图1中示出）。 清洁夹层板并用70％的乙醇完全润湿腹部。放置在它的后面的尸体和通过（i）固定在解剖板上钉的左后腿来用无菌针的动作表，（ⅱ）拉伸尸体和钉扎的右前肢的动作表，（ⅲ）钉扎的右后腿和左前腿的动作表。 拉沿使用镊子下腹部的左手侧的皮肤上，然后沿着从下腹部到使用小解剖剪胸骨尸体的左手侧切断。 延伸的切除穿过胸骨，然后向下从胸骨到使用镊子和小解剖剪小腹尸体的右手侧，以确保无下层结构的损坏。 最后，利用虹膜弯钳解剖暴露腹膜轻轻拉下皮瓣从胸骨到小腹。 轻轻抬起用镊子将腹膜和垂直切开，露出内脏，以确保没有潜在的器官受损。 8.收集胃肠道识别胃，小肠，盲肠，结肠和肠系膜淋巴系统。 轻轻横切在两侧取出胃，再放入含有1.6毫升无菌PBS用无菌镊子一个小巧玲珑。 样结肠的直肠。小心地将整个肠道大众使用解剖镊和地点在无菌培养皿中的尸体。确保做到这一点轻轻地使肠道结构和肠系膜淋巴结构不分开。 9.分离的胃肠道和肠系膜淋巴系统（图2） 倾30毫升无菌PBS放入培养皿中，以确保在胃肠道被完全淹没。 确定肠系膜淋巴系统的核心质量，并掐使用精细解剖钳。找出小肠最近端和捏用细镊子剥离。 慢慢地将CENTRA肠系膜淋巴系统和远端小肠中沿相反的方向，直到两个组织的升质量都完全彼此分离。小心执行此过程，以确保小肠未拉伸的，因为这可以防止近侧，中间和远侧区的重现性集合。将肠系膜淋巴系统中的300 – 500微升无菌PBS，并放置在冰上。 10.切片胃肠道横切GI道在盲肠从结肠分离小肠。 将在300结肠 – 500微升无菌PBS，并置于冰上。 收集来自小肠的近端，中间和远端区域的代表性组织。对齐从中点小肠。 然后，（ⅰ）收集的最后2厘米之前盲肠作为远端小肠组织的，（ⅱ）收集由5所述组织 – 6厘米以上的中点作为近端小肠，并（ⅲ）收集来自3所述组织 – 下方5厘米的中点作为中间小肠。 11.收集肝脏切除的胃之后识别大鼠肝脏的三波瓣内。 叶拉离用细镊子解剖腹腔。 切割用细剪刀任何附加韧带取出肝脏。将肝脏在300 – 500微升无菌PBS，并置于冰上。 12.收集脾确定脾脏。 脾拉离胃和用细剪刀剪开胃脾韧带。 将脾脏在300 – 500微升无菌PBS，并置于冰上。 13.收集肾脏鉴定肾脏，将在腹腔中取出时对胃肠道和其他器官的背面变得可见。 切输尿管及任何附韧带ü唱精细解剖剪刀，用细镊子取出肾脏。删除肾上腺和用细镊子和剪刀剥离任何脂肪物质（如果还连着）。 将两个肾脏在300-500微升无菌PBS，并放置在冰上。 14.收集脑断头后，按住头用弯钳垂直位置。掐皮肤上的头部纵向使用另一套弯钳的顶部，并用细解剖剪一个切口。切颈部附近剩余的皮肤，再纵向与精细解剖剪刀。 采用两侧细镊子揭示头骨和删除使用精细解剖剪刀皮瓣拉扯皮肤向外的方向。将精细解剖剪刀脊柱开幕，并沿走向主席台颅骨切开。 用细镊子的方向向外拉头骨的两个部分。切去除颅骨段。 <l我>广泛使用镊子，使用从朝主席台脊柱开幕向上运动舀取出大脑。洗了脑在PBS两次，以去除任何血液斩首的过程。 15.组织处理和均质化对于需要生存能力计数或DNA提取，放置组织成含有无菌PBS试管实验。立即通过在PBS中系列稀释，并镀上麦康凯琼脂平板上，或存储在-20℃下用20％的甘油用于短期测定存活菌数。对于DNA的提取，存储组织于-20℃下。 对于需要的RNA提取，放置组织成的RNAlater溶液适当体积（每1毫克组织10微升）的实验中，然后立即储存在-20℃下短期或在-80℃下长期贮存。 对于实验需要成像，地方的组织在10ml Methacarn溶液（60％甲醇，30％的氯仿和10％乙酸），那么存储吨室温（20 – 25℃）达3周。 按重量计管的前和加入组织后的比较计算组织重量。均质使用匀浆组织。在无菌PBS中的各样品的均质化之间洗一次均化器在70％乙醇和两次。 注：Methacarn固定是期望的肠样品的固定，以保持粘蛋白相关的粘膜防御结构;福尔马林固定可用于全身组织。