JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em> Coli Escherichia</em> זיהום בעכברוש הילודים

Published: October 29, 2014
doi:
10.3791/52018
, , , ,
1School of Pharmacy,University College London, 2Mucin Biology Group,University of Gothenburg

Summary

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

Abstract

חקירה של יחסי הגומלין בין בעלי החיים ומארח הפתוגן חיידקים היא משמעותית רק אם מודל הזיהום המועסק משכפל את המאפיינים העיקריים של ההדבקה הטבעית. פרוטוקול זה מתאר הליכים להקמה וההערכה של זיהום מערכתי עקב K1 coli Escherichia neuropathogenic בחולדה בילוד. קולוניזציה של מערכת העיכול גורמת להפצה של הפתוגן לאורך מסלול מעי-לימפה-דם-המוח של זיהום והמודל מציג תלות גיל חזקה. זן של א ' coli O18: K1 בארסיות משופרת עבור העכברוש בילוד מייצר שיעורים גבוהים במיוחד של קולוניזציה, טרנסלוקציה לתא הדם והפלישה של קרומי המוח הבאים מעבר דרך המקלעת דמית העין. כמו במארח האנושי, חדירה של מערכת העצבים המרכזית מלווה בדלקת מקומית ותוצאה תמיד קטלנית. המודל הוא של שירות מוכח ללימודים של המנגנוןשל פתוגנזה, להערכת התערבויות טיפוליות, ולהערכה של אלימות חיידקים.

Introduction

זיהומים חיידקיים מערכתיים הם איום עיקרי לרווחת ולהישרדותו של הוולד; פגים פגיעים במיוחד. דלקת קרום המוח בילוד בקטריאלי (NBM), קשור לעתים קרובות עם אלח דם חיידקים, ממשיך להיות מקור משמעותי לתמותה ותחלואה בשבועות הראשונים לחייהם והבעיה מחריפה בפיתוח המתמשך של התנגדות לתרופות אנטי-בקטריאלי חזית 1,2. מקרה של NBM הוא מצב חירום רפואי שנושא בנטל רפואי, חברתי וכלכלי גבוה 3; כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בתרופות חדשות ו, במיוחד, אסטרטגיות מניעתי רומן להפחית את הנטל של זיהום. חלק מהתכונות של NBM הן יוצאי דופן: בעולם המפותח, Escherichia coli וקבוצת B סטרפטוקוקוס אחראים לרוב הגדול של המקרים ואת היכולת של זנים אלה כדי לעורר NBM כמעט תמיד קשור בנוכחות של CA פוליסכריד מגןpsule המאפשר פתוגן להתחמק הכרה חיסונית מעבד 4. אחוז גבוה מאוד (80-85%) של neuroinvasive E. coli להביע כמוסת K1 5,6, פולימר חומצת polysialic α-2,8 צמוד שהוא מבני זהה לארח מאפננים של פלסטיות עצבית 7.

ההערכה של תרופה חדשה ואמצעי מניעה לNBM ובקטרמיה קשורה ואלח דם הייתה ברורה תועלת ממודל של בעלי חיים חזק של זיהום המחקה את התכונות העיקריות של המחלה בילוד האנושי, בפרט בגיל-התלות החזקה והמסלול הטבעי של זיהום . מגוון רחב של מודלים לדלקת קרום המוח חיידקית שלילי גרם גראם-חיובי והם זמינים 8,9 ואלה שיש לי משמעותי הרחיבו את הידע של אפשרויות פתוגנזה, פתופיזיולוגיה וטיפול בזיהומים אלה שלנו. כך, זיהומים ניסיוניים בחולדות, עכברים, ארנבים וקופים היו בשימוש ללמוד דלקת קרום מוח בשני neonate והמבוגר. עם זאת, רבים מהמודלים האלה להעסיק הזרקה תת עורית או intracisternal ישירה של חיידקים לייזום של זיהום, יצירת פתוגנזה מלאכותית על-ידי עקיפת תהליכים טבעיים של הפצה מהאתר של קולוניזציה. בחלק מהמקרים בשיטות של חיסון אלה הביאו לשינויים משמעותיים בפתולוגיה; לדוגמא, מנהל תת-עורי של א ' coli זני K1 ביטלו את גיל תלות הקשורים לזיהום הטבעי, ייצור בקטרמיה ופלישה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בשני ילודים ומבוגרים 10. נטייה לE. coli NBM תלוי באופן קריטי על העברת אנכית של הסוכן סיבתי מאם לתינוק באו מייד לאחר לידת 11. אימהי המופק E. חיידק E. K1 ליישב את מערכת עיכול של ילוד (GI) 11-13, שהוא סטרילי בלידה, אבל במהירות רוכשת חיידקים מורכבים 14. בילודים יישבו, E. coliיש חיידקי K1 יכולת translocate מחלל המעי למחזור הדם המערכתי לפני הכניסה למערכת העצבים המרכזית על פני מחסום הדם-המוח או מחסומי נוזל דם-המוח והשדרה 9,15. העיצוב של דגמים חזקים של זיהום ניסיון צריך לקחת פרטים אלה בחשבון.

למרות שעכברים היו בשימוש נרחב למחקר של צורות מסוימות של דלקת קרום מוח חיידקית 8, הם אינם מתאימים ללימודים של זיהום בילוד: הם מוצפים על ידי זיהום מערכתי ולא מראים אופייני תלות גיל החזקה של תינוקות אנושיים 16. יתר על כן, α-defensins, פפטידים מפתח של מערכת עיכול מתן הגנה מפני פלישה מערכתית על ידי א coli K1 17, באים לידי ביטוי מאוד בתאי פנט ונויטרופילים בבני אדם ובחולדות, אך לא בעכברים 18. יש מידה ראויה לציון של כפילות, יתירות וההטרוגניות בdefensin עכבר והגנים cryptidin קשורים לא נמצאה באחרimals 19. העכברוש בילוד שימש בתחילה על ידי Moxon ועמיתים לעבודה 20 לחקור את פתוגנזה של דלקת קרום מוח המופילוס אינפלואנזה הבאה חיסון intranasal, משכפלים את האתר הטבעי של קולוניזציה של הפתוגן בילוד באדם, ולאחר מכן הותאם לתלוי גיל E. בקטרמיה coli K1 ודלקת קרום מוח. Bortolussi et al. 21 זריקת intraperitoneal מועסק של הבידוד החיידקים ליזום זיהום, אך המחקר המרכזי של Glode ועמיתים לעבודת 22 האכלת קיבה דרך הפה בשימוש במקביל לתוואי הטבעי של זיהום לאחר קולוניזציה GI. כצינור הקיבה עלול לגרום נזק משטחים ריריים, ההליך היה מעודן לכלול האכלה של הבידוד לילודים 23. כאן, השיטה להתיישבות מערכת עיכול ונהלים למעקב אחר הזיהומים בגורי חולדה רגישים מתוארים; בנוסף, יישומים טיפוליים ומניעתי של המודל נדונים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו במחקר זה תאמו את חקיקה לאומית ואירופית ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לרוקחות UCL והמשרד בבריטניה הבית (HO). כל העבודה בבעלי החיים שנערכה במסגרת פרויקט HO רישיונות PPL 80/2243 וPPL 70/7773. 1. עכברוש הכנה לבצע את כל in vivo הניסויים באמצעות חולדות ילודות Wistar הפתוגן ללא. שמור את כל המלטות העכברוש (12 ילודים למושבה) בכלובים בודדים עם אמהותיהם נשים (9 – 11 בשבוע שנקבות זקנות), בתנאים אופטימליים (19-21 מעלות צלזיוס, 45-55% לחות, 15-20 שינויי אוויר / שעה ו 12 שעות אור / חושך מחזור). 2. תא חיידק הכנה חנות E. מניות coli K1 ב -20% (V / V) גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס. עבור כל ניסוי, צלחת את חיידקי המניה על מילר-הינטון (MH) צלחות אגר, ולדגור על 37 מעלות CO / N. היום לפני ההאכלה, inocuמאוחר 10 מיליליטר של מרק MH עם ה יחידה מושבה והתרבות O coli K1 / N על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד. כביקורת על זיהום בינוני, להכין 10 מיליליטר של מרק MH uninoculated ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד. העברת O / השעיה חיידקי N 100 μl ל9.9 מיליליטר של מרק MH (1: 100 V / V), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד, עד שיגיע לאמצע מעריכי-שלב, מתאים לצפיפות אופטית של 0.6 הנמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD 600). 3. האכלת חולדות ילודים עם א ' K1 coli צמד בעדינות את בעלי החיים בצורה אנכית ביד אחת מהעורף, המאפשר לפתוח את הפה. לאט לאט להכניס את קצה פיפטה סטרילית לתוך פיו של בעל החיים, ופיפטה 20 μl של הבידוד (~ 37 ° C) לתוך הפה של בעלי החיים על פני פרק זמן של 30 שניות. להחזיר את בעל החיים לאמו מייד לאחר הנקה. ודא ש4 – 8 x 10 6 חיידקים לא האביסו to כל גור על ידי דילול סדרתי של הבידוד בPBS ואיתור על גבי צלחות אגר MH. 4. הערכה של התיישבות על ידי א K1 coli צמד בעדינות את החיה ביד אחת מהעורף. להרטיב מקל אוזני סטרילי בסטרילי PBS, ולאחר מכן בעדינות לשטוף את האזור פי הטבעת. להחזיר את בעל החיים לאמו מייד לאחר קירצוף. הנח את קצה הצמר-הגפן לצינור המכיל 300 μl של PBS סטרילית ולאחסן על קרח. לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey. לקבוע א קיימא coli K1 על ידי בדיקת רגישות bacteriophage. פיק מושבה בודדת באמצעות לולאת מיקרוביולוגית סטרילי, טבל 200 μl סטרילי PBS, אז בכפוף לערבוב מערבולת. באמצעות לולאת מיקרוביולוגית סטרילי, תת-תרבות על אגר MH בקו ישר. לאפשר את הצלחת לייבוש למשך 30 שניות, ולאחר מכן פיפטה 10 μl של BACK1E teriophage (10 9 פלאק ויוצרים מיליליטר / יחידות (PFU / ml)) על גבי במרכז הקו. דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לבחון את הצלחת לתמוגה בתיווך bacteriophage. 5. הערכה של מחלת חומרה להעריך את חומרת המחלה של כל חיה 4 – 5 פעמים ביום באמצעות מערכת ניקוד שבע נקודות המפורטים בטבלה 1. אם ציונים של בעלי חיים ≥3 מתוך 7, לברור באופן מיידי לבעלי החיים כדי למזער את הסבל. רשום את בעלי החיים למתים. 6. Euthanization של חולדות ילודים ודם אוסף צמד בעדינות את החיה ביד אחת, וחושף את הראש וצוואר. לחטא את צווארו של בעל החיים על ידי מנגב עם ספוגית אלכוהול. לחטא זוג מספריים גדול באמצעות אתנול 70%, לפני השטיפה בPBS סטרילי כדי להסיר אתנול עקבות. צמד בעדינות את בעלי החיים ישירות מעל צלחת פטרי. לערוף את הילוד באמצעות surgi החדמספריים קאל, על מנת להבטיח כי הדם מטפטף לתוך צלחת פטרי. יש להימנע ממגע עם הראש על מנת למנוע זיהום של דם עם צמחיית עור. מייד לאסוף את הדם באמצעות פיפטה סטרילית ומערבבים עם מלח נתרן הפרין בריכוז של 20-50 מיליליטר / יחידות בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey. לקבוע את מספריו של ע 'בר-הקיימא coli K1 על ידי בדיקת הרגישות של חיידקי קיימא לK1E bacteriophage. 7. Dissection בעקבות עריפת ראשו של העכברוש בילוד, להשתמש תנאי ספטית לחתוך ולאסוף רקמות של עניין. לשטוף את כל המכשירים (מוצגים באיור 1) ב- 70% אתנול וסטרילי PBS. נקה את הלוח לנתיחה ולהרטיב את הבטן לגמרי עם 70% אתנול. מקם את הגופה על הגב שלה ולתקן ללוח לנתיחה על ידי (i) מצמיד את רגלו האחורית השמאלית לשולחן העבודה עם מחט סטרילית, (ii) מתיחת הגופה ומצמיד את הרגל הקדמית הימנית לשולחן הפעולה, (iii) מצמיד את רגל ימין אחורית ורגל קדמית השמאלית לשולחן הפעולה. משוך את העור לאורך הצד השמאלי של הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים, ואז לחתוך לאורך צדו השמאלי של הגופה מהבטן התחתונה לעצם החזה באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. להאריך את הכריתה פני עצם החזה, ואז למטה בצד ימין של הגופה מעצם החזה ועד הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים ומספריים לנתיחה קטנה, להבטיח שאף אחד ממבני היסוד פגום. לבסוף, משוך בעדינות את דש העור מעצם החזה ועד הבטן התחתונה באמצעות קשתית מלקחיים לנתיחה מעוקלות כדי לחשוף את הצפק. בעדינות להעלות את הצפק עם מלקחיים ולחתוך בצורה אנכית על מנת לחשוף את האיברים הפנימיים, כדי להבטיח שאף אחד מהאיברים שבבסיסם ניזוקו. 8. איסוףמערכת העיכול זהה את הקיבה, מערכת הלימפה mesenteric מעי דק, cecum, מעי גס ו. הסר את הבטן בעדינות על ידי transecting בכל צד, ואז למקם לתוך קומפקטי המכיל 1.6 מיליליטר של PBS סטרילי באמצעות מלקחיים סטריליות. Transect המעי הגס בפי הטבעת. משוך בזהירות את המסה במעי כולו מהגופה באמצעות מלקחיים לנתיחה ומניחים בצלחת פטרי סטרילית. ודא שזה נעשה בעדינות כך שמבנה המעיים ומבני הלימפה mesenteric אינם מפריד. 9. הפרדה של מערכת העיכול ומערכת הלימפה mesenteric (איור 2) יוצקים 30 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך צלחת פטרי, להבטיח את מערכת העיכול היא שקועה לחלוטין. זהה את המסה של מערכת הלימפה mesenteric המרכזית, ולצבוט באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. זהה את החלק הפרוקסימלי ביותר של המעי הדק, ולצבוט באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. לאט לאט למשוך CENTRAמסת l של מערכת הלימפה mesenteric והמעי הדק דיסטלי בכיוונים מנוגדים, עד שתי הרקמות מופרדות לחלוטין זו מזו. לבצע תהליך זה בזהירות כדי להבטיח שהמעי הדק לא נמתח, כמו זה מונע גבייה לשחזור של הפרוקסימלי, אמצע ואזורי דיסטלי. הנח את מערכת הלימפה mesenteric ב300-500 μl סטרילי PBS ומניח על קרח. 10. חתך של מערכת העיכול Transect מערכת העיכול בcecum להפריד המעי דק מהמעי הגס. הנח את המעי הגס ב300-500 μl סטרילי PBS ומניח על קרח. דגימות של רקמות נציג מאזורים הפרוקסימלי, אמצע ואחורי של המעי הקטן. יישר את המעי דק מנקודת האמצע. ואז, (i) לאסוף את 2 סנטימטר האחרון של רקמה לפני המעי האטום כמו המעי הדק דיסטלי, (ii) לאסוף את רקמת 5-7 סנטימטר מעל לנקודת האמצע כמו המעי הדק הפרוקסימלי, ו(Iii) לאסוף את רקמת 3-5 סנטימטר מתחת לנקודת האמצע כמו המעי הדק האמצע. 11. איסוף הכבד לזהות שלוש אונות של כבד החולדה לאחר ההסרה של הקיבה. משוך אונות מחלל הבטן באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. הסר את הכבד על ידי חיתוך כל רצועות חיבור באמצעות מספריים עדינים. הנח כבד ב300-500 μl סטרילי PBS ומניחים על קרח. 12. איסוף הטחול זהה את הטחול. משוך טחול מהבטן ולהשתמש במספריים עדינים לחתוך את רצועות gastrosplenic. הנח טחול ב300-500 μl סטרילי PBS ומניחים על קרח. 13. איסוף הכליות זהה את הכליות שתהיינה גלויים בחלק האחורי של חלל הבטן עם ההסרה של המערכה העיכול ואיברים אחרים. השופכנים Cut וכל רצועות הצמדת uלשיר מספריים לנתיחה קנס ולהסיר כליות באמצעות מלקחיים בסדר. הסר בלוטת יותרת הכליה וכל חומר שומני (אם עדיין מחובר) באמצעות מלקחיים בסדר ומספריים לנתיחה. הנח שני הכליות ב300-500 סטרילי PBS μl ומניח על קרח. 14. איסוף המוח לאחר עריפת הראש, להחזיק את הראש בתנוחה זקופה באמצעות מלקחיים מעוקלים. צובט את העור על ראש של אורכית באמצעות קבוצה נוספת של מלקחיים מעוקלים, ולהפוך את חתך באמצעות מספריים לנתיחה קנס. לחתוך את עור שנותר ליד צוואר, שוב אורכית עם מספריים לנתיחה קנס. משוך עור בכיוון החוצה באמצעות מלקחיים בסדר בשני הצדדים כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר דשי עור באמצעות מספריים לנתיחה קנס. הנח מספריים לנתיחה קנס בפתיחת השדרה ולעשות חתך לאורך הגולגולת לכיוון הדוכן. משוך את שני החלקים של גולגולת בכיוון החוצה באמצעות מלקחיים בסדר. חותך להסרת מקטעי גולגולת. <li> הסרת מוח באמצעות מלקחיים רחבים, תוך שימוש בתנועה כלפי מעלה גורפת מפתיחת השדרה לכיוון הדוכן. שטוף את המוח בPBS פעמיים כדי להסיר כל דם מהליך עריפת הראש. 15. עיבוד רקמות ולתפעול בניסויים הדורשים ספירת כדאיות או מיצוי DNA, רקמות מקום לצינורות המכילים סטרילי PBS. מייד לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey, או בחנות ב -20 ° C עם גליצרול 20% לטווח קצר. להפקת DNA, רקמות חנות ב -20 ° C. בניסויים הדורשים מיצוי RNA, רקמות מקום באמצעי האחסון מתאים של פתרון RNAlater (10 μl לכל רקמת 1 מ"ג), ולאחר מכן לאחסן באופן מיידי ב -20 ° C לטווח קצר או באחסון לטווח ארוך -80 מעלות צלזיוס. בניסויים הדורשים הדמיה, רקמות מקום 10 מיליליטר פתרון Methacarn (מתנול 60%, כלורופורם 30% ו -10% חומצה אצטית), לאחר מכן לאחסןלא RT (20-25 מעלות צלזיוס) לתקופה של עד 3 שבועות. לחשב את משקל רקמה על ידי השוואת משקל של צינורות של לפני ואחרי תוספת של רקמות. Homogenize רקמות באמצעות homogenizer. שטוף את homogenizer פעם אחת בשנת 70% אתנול ו פעמים PBS סטרילי בין הומוגניזציה של כל דגימה. הערה: קיבעון Methacarn רצוי לקיבעון של דגימות מעיים במטרה לשמר את מבני הגנה ריריים הקשורות mucin; קיבעון פורמלין עשוי לשמש לרקמות מערכתיות.

Representative Results

E. מודל זיהום מערכתי coli K1 המתואר כאן משכפל רב מהתכונות של ההדבקה הטבעית בבני אדם. החיידקים הם מעובדים, ליישב את מערכת העיכול, translocate לתוך תא הדם דרך בלוטות לימפה mesenteric לפני הקמת מחלה ספציפית לאיבר עם הדלקת הקשורים במוח 24. חשוב לציין, המודל מציג תלות גיל חזקה; כפי שמוצגים באיור 3, גורי חולדה שתי בנות יום (P2) רגישים מאוד למחלה פולשנית אלא על פני תקופה של שבעה ימים והחיות נעשות יותר ויותר עמידות לזיהום, אך לא למערכת עיכול קולוניזציה בדרכי 17. לאחר מעבר מהאתר של קולוניזציה GI לתא הדם, יכולים להיות דמיינו את החיידקים בדגימות דם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4) לפני הכניסה למערכת העצבים המרכזית בעיקר במקלעת דמית העין 25. אצל בעלי חיים מסוימים, יש פלישה נרחבת של איברים מרכזיים אחרים כגוןריאות, טחול וכליות 25. מספרי חיידקים ברקמות יכולים להשתנות באופן משמעותי בין גורים הבודדים 25 אבל כאשר bioburden הוא הבקיע כמו גם בהווה או בנעדר יש רמה גבוהה של שחזור בכל קשור לפלישת איבר. בשגר של 12 גורים כעוקבת בדיקה אחת, חישובי כוח באמצעות ה- G * תוכנת כוח נקבעו כי גודל מדגם זה משווה להסתברות 98.6% להימצאות השפעה המבוססת על הישרדות באמצעות שישה בעלי חיים מהמחזור ו> הסתברות של 99% אם כל שנים עשר נלקחות בחשבון. המודל לכן הוא מתאים להערכה של תרופות חדשות מותאמות במיוחד לטיפול בזיהומים חיידקיים בילוד ונעשה שימוש בהליך כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של הכמוסה depolymerase EndoE כי סלקטיבי מסירה את הקפסולה K1 ממשטח חיידקי 24-26. גם זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מארח-חיידקים המשפיעים על הטפיחהhogenesis של א ' neuropathogens coli; בהקשר זה היא שמשה ללימודים של א ' קולוניזציה coli A192PP והפצה. הוכח כי א קולי תאי A192PP להתמיד במערכת העיכול של גורי P2, P5 וP9 במספרים גדולים; היבטים זמניים של קולוניזציה בשלוש קבוצות אלה היו דומים מאוד (איור 5) ומשקפים את היכולת של החיידקים כדי לשכפל ולשמור על צפיפות אוכלוסייה בתוך הבטן. הארסיות של A192 הבודד הקליני הייתה משופר על ידי מעבר סדרתי בחולדות ילודות כדי להבטיח יתירות מעט או ללא שימוש בבעלי חיים. E. coli A192 יישב חולדות ילודות P2 עם 100 יעילות%, שהושרו בקטרמיה ב -35% מבעלי החיים וניב תוצאה קטלנית ב -25% 27. A192PP הנגזר passaged colonizes מערכת העיכול, מייצר בקטרמיה וגורם קטלני בכל גורי P2. כך, המודל יכול להיות מועסק על מנת לחקור את האלימות של דיfferent K1 זנים ביחס ליכולתם לחדור לתוך מערכת העצבים המרכזית ומערכות גוף שונות מהאתר של קולוניזציה. בהקשר זה, Pluschke ועמיתים לעבודה 23 השתמשו במודל זיהום עכברוש בילוד כדי לקבוע את הקיבולת של 95 E. coli K1 זנים ממקור אנושי כדי לגרום לבקטרמיה לאחר קולוניזציה הבטן; הם נצפו וריאציות רחבות ביעילות של שני קולוניזציה ויכולת פולשנית, שבבסיס הטבע המשובט של א ' coli K1 neuropathogens. איור 1. חומרים לאוסף רקמות: (א) בקנה מידה במשקל, (ב) צינורות-שקל מראש המכילים תקשורת הכרחית, (ג) פעולת שולחן, שליט ומחטים להצמיד בעלי החיים, 70% (ד) (V / V) אתנול וPBS לעקר ציוד אוסף רקמות, <sטרונג> ערכת איסוף רקמות כוללים זוג מספריים גדול לעריפת הראש והמספריים ופינצטה ולהבים בגדלים שונים ובצורות קרח, (F) לשימור הרקמות (E), (G) 70% (V / V) אתנול לחיטוי שולחן הפעילות ומקיף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. הפרדה של מערכת העיכול ומערכת הלימפה mesenteric. גריפ ההמוני של מערכת הלימפה mesenteric עם מלקחיים לנתיחה קנס המרכזי מערכת עיכול מערכת הלימפה mesenteric (). גריפ (ב ') החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, ומושך בכיוונים מנוגדים. (ג) וseparat מלאדואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. הישרדות של גורי חולדה יילודים בגילים מ יומיים (P2) לתשעה ימים (P9) לאחר נטילה דרך הפה של א ' coli A192PP, הממחיש את תלות גיל החזקה של זיהום מערכתי. כל קבוצה מייצגת 24 ילודים. איור 4. תמונות הקרינה של ה קולי תאי A192PP בכתם דם מגור P2 נגועים לאחר הנטילה דרך הפה של חיידקים. אנטיגן O lipopolysaccharide על פני השטח של החיידקים היה stained עם נוגדן ארנב נגד O18 polyclonal ונוגדן שני עז-נגד ארנב Alexa546 מצומדות-. כמוסת K1 הייתה דמיינה עם מגיב EndoE-GFP. כמעט כל החיידקים שאותרו בדגימות דם מוצג כמוסת K1 מגן. תמונות שנתפסו על ידי ד"ר אנדריאה Zelmer. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5. E. הממשל הבא קולוניזציה במעי coli A192PP של הבידוד החיידקים. DNA הופק מכל מעי וא רקמת coli K1 המושבה להרכיב יחידות / g (CFU / g) שנקבעה על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותית (QPCR) מיקוד גן polysialyltransferase (Neus) כפי שמתוארת במקום אחר 17 </sup>. לוד: גבול של זיהוי. תכונה בריא לא בריא צבע של העור ורוד חיוור / צהוב Agility (רפלקס ליישר) גור הופך באופן מיידי על מיקום אחורה קושי בהיפוך מיקום לאחור (> 3 שניות) או לא יכול להשיג לחץ עדין על הבטן אין קול קול של תסיסה בטן קו חלב / גלוי ולבן לא נראה לעין טמפרטורה חם * קר יחסית משקל רווח של 1.5-2 גרם ליום ללא עלייה במשקל או ירידה במשקל התנהגות כאשר הניחו בכלוב נע לכיוון אמא ומתחיל Feeding לא יכול לזוז לכיוון אמא ומראה האכלת קושי 1. מערכת שולחן שבע נקודות ניקוד: שלושה הציונים הראשונים ברשימה הן בדרך כלל הסימנים הראשונים שנצפו. * ילודים עם טמפרטורת זיהום מערכתי ניסיון מוגבה גוף (> 2 מעלות צלזיוס). עם זאת, בשל חוסר הגמישות של בעלי החיים כדי להגיע לאמא שלהם כדי לשמור על טמפרטורת גוף, בעלי חיים לא בריאים עשויים להיות מופרדים מהפסולת ומרגישים קר ליד החשופה.

Discussion

מודל החיה המתואר כאן מתבסס על עבודה קודמת שנועדה לשחזר את המאפיינים הבולטים של מתרחש באופן טבעי בזיהומים בבני אדם. חולדות בילוד בתחילה הועסקו ללמוד דלקת קרום מוח תינוקות עקב H. סוג אינפלואנזה b כמינים עומדים בקריטריונים המרכזיים למודל חזק של זיהום. כך, פורטל כניסה של הפתוגן הרלוונטי צריך לשקף את זה של הדבקת בני אדם הטבעית וreproducibly להצמיח פתולוגיה דומה של משך מספיק כדי לאפשר התערבות טיפולית. הטכניקות המשמשות לא צריך להגביל את תחולתו של ההליך ולא צריך לתרום לתוצאה מחלה 20. המודל של ה ' דלקת קרום מוח המופילוס בחולדות תינוק שפותחו על ידי Moxon ועמיתים עונה על קריטריונים אלה 20; ההדבקה הטבעית מתרחשת לאחר קולוניזציה של הקרומים הריריים של דרך הנשימה העליונה, תכונה חשובה זו שוכפלה בגורי החולדה על ידי אי-טראומההחדרת טיקים של החיידקים על גבי הקרומים של מעברי האף. חשוב לציין, הטבע תלוי הגיל של הזיהום היה משוכפל במודל.

אותה הקבוצה גם היתה הראשונה לפתח מודל לא פולשנית של א ' coli K1 NBM בחולדה בילוד 22. גורי ספראג-Dawley הפתוגן ללא שיישבו על ידי האכלת 8 אוקטובר – 10 אוקטובר חיידקים דרך צינור קיבה דרך הפה; הבידוד לכן היה גבוה במידה ניכרת מזה מועסק על ידינו. קולוניזציה עם שלושה זני K1 בדקו, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) ו- LH (O75: K1: H3), התרחשה בשיעור גבוה יחסית (48-74%) של K1-האכיל בעלי חיים, אבל מקרים של בקטרמיה, דלקת קרום המוח ולתמותה היו משתנים ונמוכים משמעותי משיעורים של קולוניזציה. הטבע המשובט של א ' זיהום ניסיון coli K1 הוקם מאוחר יותר 23 ונראה עכשיו כי רק O18: K1 ו, ובמידה פחותה, O7: קפסיד K1 יכוליםלגרום באופן עקבי זיהום מערכתי. מסיבה זו, החקירות של פתוגנזה של א 'neuropathogenic אלה coli K1 היו מבוסס על השימוש בO18 משופר הארסיות: A192PP מתח K1. השוואה של א ' האכלת coli K1 של חולדות בילוד דרך צינור קיבה, כפי שGlode ועמיתי 22, ושיטת האכלת טיפה כפי שהיא מתבצעת על ידי הקבוצה של Achtman 23 חשפו מספרים מוגזמים של מוות תוך שימוש בשיטה הקודמת, כמעט בודאות כתוצאה מניזק לרירית משטחים על ידי צינור קיבה. כמו שיעורים של קולוניזציה דומים עם שתי שיטות אלה, מומלץ להשתמש בשיטה פחות פולשנית של האכלת החיידקים באמצעות פיפטה עם טיפ סטרילי, כפי שתואר בתקשורת זו.

A192PP זן החיידק המשמש במחקרים שלנו הוא O18: K1. זה הוא נגזר אלים יותר של הזן הקליני E. A192 coli שהתאושש במקור ממטופל עם הרעלת דם 27 </sup>. האלימות המוגברת של הזן הייתה מתקבלת על ידי מעבר סדרתי דרך חולדות ילודות 26. המתח מעורר את חומרת מחלה תלוית גיל, עם בקטרמיה 100% ותמותה כאשר ניתן לבעלי החיים ישנים 2 יום 28. בניגוד לכך, ישנות חיות 9 יום הן לגמרי עמידות למחלות. K1 הספציפי bacteriophage ממס ניתן להשתמש כדי לבדל את ה coli K1 מא האחר coli זני 29. במחקר זה, רגישות של חיידקי קיימא לK1E bacteriophage יש להשתמש כדי (i) לבדוק את הטוהר של E. השעיות coli K1 מוכנות להיות מוזנות לבעלי החיים, וכן (ii) כדי לבדל את E. K1 coli מהקוליפורמים אחרים על מנת לחשב את הכדאיות במטליות פי טבעת, דם ודגימות רקמה. אם המושבה היא E. coli K1, זה יהיה רגיש לתְמוּגָה K1E bacteriophage, והתפתחות חיידקים יהיו מעוכב באתר של חיסון bacteriophage. אם המושבה לא E. coli K1, זה יהיה בדואר עמיד לתְמוּגָה bacteriophage kie, ולא צריך להיות על שטח של התפתחות חיידקים באתר של חיסון bacteriophage. יש לזכור שמודלים של בעלי החיים אינם יכולים לשקף את כל התכונות של המחלה מתרחשת באופן טבעי. המודל הנוכחי יכול להיות שונה כדי לבחון את מאפייני האלימות של חיידקי neuropathogenic אחרים מאשר E. ניתן לאכלס coli A192PP ושינויים בגודל של הבידוד והמיישבים. יישומים עתידיים של הטכניקה יכולים לכלול ההערכה של תרופות נחוצות לטיפול במצב ולחשוף פרטים על תשובות המארח לפלישת קולוניזציה ורקמה.

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה אך יעילה. המלטות יחידה של 10-12 גורים הועסקו כקבוצות מבחן או שליטה וגישה בתוך-אפריון זה מבטיחה רמה גבוהה של שחזור ותוקף סטטיסטי. זה הכרחי כי הגורים יוחזרו לאמהות טבעיות שלהם בהקדם האפשרי לאחר כל procedurדואר והמלטות לא צריכים לכן מהווים חיות עוברות התערבויות שונות. חשוב שהבידוד נמאס לחמם אחרת הגורים ידחו את התרבות המוצעת. הגורים לפתח במהירות חיידקים מורכבים ובתוך יומיים של לידה במערכת העיכול היא יישבה עם מגוון רחב של חיידקים מהמערכת הנוספת שהוקמה כחיידקים הנפוצים ביותר במעיים של התינוקות ומבוגרים. גורים שלא היה מאכילים א coli A192PP אינו נושא את ה coli K1 נחישות במערכת העיכול 17 וכן שיעורים של קולוניזציה היא פשוטה יחסית. עם זאת, Neus המבוסס על מתקפות שיטת qPCR לגילוי של מיישבי E. coli K1 הוא הרבה יותר רגיש כי שיטות תרבות מסורתיות, והוא מומלץ בחום 17.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי G0400268 מענקי מחקר וMR / K018396 / 1 מהמועצה למחקר הרפואי, ועל ידי מחקר רפואי פעולה. תמיכה נוספת סופקה על ידי המכון הלאומי לחקר בריאות באוניברסיטת קולג 'בלונדון בתי חולים ביו-רפואי מרכז מחקר.

Materials

Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK www.harlan.com
E. coli K1 A192PP Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Glycerol  Sigma, UK www.sigmaaldrich.com G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0337
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK www.oxoid.com CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P4417
Ethanol 100% Sigma, UK www.sigmaaldrich.com E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 84020
Prepare 20-50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK www.sigmaaldrich.com R0901
10µl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 320099
Chloroform Sigma, UK www.sigmaaldrich.com C2432
Methanol Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK www.scientificlabs.co.uk SWA1000
Petri dishes Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P5856
30mL Universal Tube AlphaLaboratories, UK www.alphalabs.co.uk CW3890
0.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1405-1500
1.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1415-1000
0.1µl calibrated loops StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points  Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK www.vwr.com USBE4251
25g Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd www.greinerbioone.com N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK www.perkinelmer.co.uk L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK www.infors-ht.com AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke www.ika.com 0003737000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
  2. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
  3. Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
  4. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  5. Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).
  6. Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
  7. Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
  8. Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
  9. Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
  10. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
  11. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
  12. Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
  13. Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
  14. Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
  15. Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
  16. Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
  17. Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
  18. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
  19. Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
  20. Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
  21. Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
  22. Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
  23. Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
  24. Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
  25. Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
  29. Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).

Tags

Neuropathogenic Escherichia ColiNeonatal RatNon-invasive Infection ModelGut-lymph-blood-brain InfectionAge-dependent InfectionE. Coli O18:K1VirulenceMeningeal InvasionCentral Nervous System InfectionPathogenesisTherapeutic InterventionsBacterial Virulence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image