JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Non-Invasive Model van Neuropathogenic<em> Escherichia coli</em> Infectie in de Neonatale Rat

Published: October 29, 2014
doi:
10.3791/52018
, , , ,
1School of Pharmacy,University College London, 2Mucin Biology Group,University of Gothenburg

Summary

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Abstract

Onderzoek naar de interacties tussen dierlijke gastheer en bacteriële pathogenen is alleen zinvol als de infectie model gebruikt een replica van de belangrijkste kenmerken van de natuurlijke infectie. Dit protocol beschrijft de procedures voor de totstandkoming en evaluatie van systemische infectie als gevolg van neuropathogenic Escherichia coli K1 in de neonatale rat. Kolonisatie van het maagdarmkanaal verspreiding van de pathogeen langs de darm-lymfe-bloed-hersen beloop en het model toont sterke afhankelijkheid leeftijd. Een stam van E. coli O18: K1 met verbeterde virulentie voor de neonatale rat produceert uitzonderlijk hoge tarieven van de kolonisatie, translocatie naar het bloed compartiment en de invasie van de hersenvliezen na doorvoer door de choroidea plexus. Zoals in de menselijke gastheer, is penetratie van het centrale zenuwstelsel vergezeld van lokale inflammatie en een onveranderlijk dodelijke afloop. Het model is van nut gebleken voor studies van het mechanismevan pathogenese, voor de evaluatie van therapeutische interventies en voor de beoordeling van bacteriële virulentie.

Introduction

Systemische bacteriële infecties zijn een grote bedreiging voor het welzijn en het voortbestaan ​​van de pasgeborene; vroeg geboren kinderen zijn bijzonder kwetsbaar. Neonatale bacteriële meningitis (NBM), vaak geassocieerd met bacteriële sepsis blijft een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit gedurende de eerste paar weken van het leven en het probleem wordt verergerd door de voortdurende ontwikkeling van resistentie tegen eerstelijns antibacteriële geneesmiddelen 1,2. Een geval van NBM is een medische noodsituatie die een hoge medische, sociale en economische last 3 draagt; dus, is er een dringende behoefte aan nieuwe therapieën en, met name, nieuwe profylactische strategieën om de last van de infectie te verminderen. Sommige functies van NBM ongebruikelijk: in de ontwikkelde wereld, Escherichia coli en groep B streptokokken zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen en het vermogen van deze stammen NBM wekken bijna altijd geassocieerd met de aanwezigheid van een beschermende polysaccharide capsule dat de ziekteverwekker in staat stelt om immuun erkenning ontwijken verwerkt 4. Een zeer groot deel (80-85%) van de neuro-invasieve E. coli drukken de K1 capsule 5,6, een α-2,8-gekoppelde polysialic zuur polymeer dat is structureel identiek aan modulators van neuronale plasticiteit 7 hosten.

De evaluatie van nieuwe therapieën en profylactische voor NBM en bijbehorende bacteriëmie en sepsis zou duidelijk gebaat bij een robuust diermodel van infectie die de belangrijkste kenmerken van de ziekte in het menselijk pasgeborene nabootst, in het bijzonder de sterke leeftijd-afhankelijkheid en de natuurlijke route van infectie . Een breed scala van modellen voor Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriële meningitis zijn 8,9 en die onze kennis van pathogenese, pathofysiologie en behandelingen van deze infecties aanzienlijk uitgebreid. Zo zijn experimentele infecties bij ratten, muizen, konijnen en apen gebruikt om meningitis bestuderen in zowel de neonate en de volwassene. Veel van deze modellen gebruiken direct intracisternale of subcutane injectie van bacteriën initiatie van infectie, een kunstmatig pathogenese omzeilt natuurlijke processen van verspreiding van de plaats van kolonisatie. In sommige gevallen zijn deze methoden van inoculatie tot significante veranderingen in de pathologie; bijvoorbeeld, subcutane toediening van E. coli K1 stammen ingetrokken leeftijd afhankelijkheid geassocieerd met de natuurlijke infectie, het produceren bacteriëmie en invasie van het centraal zenuwstelsel (CZS) zowel pasgeborenen en volwassenen 10. Aanleg voor E. coli NBM is sterk afhankelijk van de verticale transmissie van de verwekker van moeder op kind bij of kort na de geboorte 11. Maternale E. coli K1 bacteriën koloniseren de neonatale gastro-intestinale (GI) stelsel 11-13, dat is steriel bij de geboorte, maar snel verwerft een complexe microbiota 14. In gekoloniseerde pasgeborenen, E. coliK1 bacteriën het vermogen om verplaatsen van het darmlumen naar de systemische circulatie voordat het CZS door de bloed-hersenbarrière of bloed-cerebrospinale vloeistof barrières 9,15. Het ontwerp van robuuste modellen van experimentele besmetting moeten deze gegevens rekening houden.

Hoewel muizen zijn op grote schaal gebruikt voor de studie van sommige vormen van bacteriële meningitis 8, zijn zij ongeschikt voor studies van neonatale infectie: ze worden overweldigd door systemische infectie en hebben de sterke leeftijdsafhankelijkheid kenmerkend humane zuigelingen 16 vertonen. Verder, α-defensines, key peptiden van het maagdarmkanaal bescherming tegen systemische invasie door E. coli K1 17, zijn hoog tot expressie in Paneth cellen en neutrofielen in mensen en ratten maar niet in muizen 18. Er is een opmerkelijke mate van duplicatie, redundantie en heterogeniteit in de muis defensin en aanverwante cryptidin genen die niet in andere eenij dieren 19. De neonatale rat werd aanvankelijk gebruikt door Moxon en collega's 20 naar de pathogenese van Haemophilus influenzae meningitis onderzoeken na intranasale inoculatie, repliceren de natuurlijke plaats van de kolonisatie van deze neonatale ziekteverwekker in het menselijke, en vervolgens aangepast voor leeftijdsafhankelijke E. coli K1 bacteriëmie en meningitis. Bortolussi et al. 21 werknemers intraperitoneale injectie van de bacteriële inoculum om infectie te starten maar de sleutel studie van Glode en collega's 22 gebruikte orale maag voeding voor de natuurlijke route van infectie evenwijdig na GI kolonisatie. De maagsonde mucosale oppervlakken beschadigen, werd de procedure verfijnd om toevoer van het inoculum omvatten de 23 pasgeborenen. Hier omvat de werkwijze voor maagdarmkanaal kolonisatie en procedures voor het volgen van de infectie vatbare rat pups worden beschreven; bovendien, therapeutische en preventieve toepassingen van het model besproken.

Protocol

Alle dierproeven uitgevoerd in deze studie gelijkvormig aan de nationale en Europese wetgeving en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de UCL School of Pharmacy en de Britse Ministerie van Binnenlandse Zaken (HO). Alle dierlijke werk werd uitgevoerd onder HO project licenties PPL 80/2243 en 70/7773 PPL. 1. Rat Voorbereiding Voer alle in vivo experimenten met kiemvrije Wistar neonatale ratten. Bewaar alle rat nestjes (12 pasgeborenen per kolonie) in individuele kooien met hun zogende moeders (9-11 weken oude vrouwtjes), onder optimale omstandigheden (19-21 ° C, 45 – 55% luchtvochtigheid, 15 – 20 luchtwisselingen / uur en 12 uur licht / donker-cyclus). 2. Bacteriële Cell Voorbereiding Store E. coli K1 voorraden in 20% (v / v) glycerol bij -80 ° C. Voor elk experiment uitplaat voorraad bacteriën op Mueller-Hinton (MH) agar platen en incubeer bij 37 ° CO / N. De dag voor het voeden, inoculate 10 ml MH-bouillon met een E. coli K1 kolonie en cultuur O / N bij 37 ° C, 200 rpm. Als controle voor middelgrote verontreiniging bereiden 10 ml MH geïnoculeerde bouillon en incubeer bij 37 ° C bij 200 rpm. Breng 100 pi O / N bacteriële suspensie in 9,9 ml MH-bouillon (1: 100 v / v), en incuberen bij 37 ° C, 200 rpm, tot mid-exponentiële fase is bereikt, overeenkomende met een optische dichtheid van 0,6 gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD 600). 3. Het voeden van pasgeboren ratten met E. coli K1 Houdt zacht het dier verticaal in één kant van het nekvel, waardoor de mond te openen. Langzaam steek de steriele pipet tip in de mond van het dier, en pipetteer 20 ul van het inoculum (~ 37 ° C) in de mond van het dier gedurende een 30 sec periode. Breng het dier naar zijn moeder onmiddellijk na de voeding. Controleer of 4 – 8 x 10 6 bacteriën zijn gevoed to elke pup door seriële verdunning van het inoculum in PBS en spotten op MH agarplaten. 4. Beoordeling van de kolonisatie door E. coli K1 Zachtjes Houd het dier in de ene hand van de nekvel. Bevochtig een steriel wattenstaafje in steriele PBS, en dan veeg voorzichtig over het perianale gebied. Breng het dier naar zijn moeder onmiddellijk na zwabberen. Plaats het wattenstaafje tip in een buisje met 300 pi steriel PBS en bewaar op ijs. Bepaal het aantal levende bacteriën door seriële verdunning in PBS en uitplaten op MacConkey agarplaten. Bepaling van levende E. coli K1 door bacteriofaag gevoeligheid getest. Pluk een individuele kolonie met een steriele microbiologische lus, gedoopt in 200 pi steriel PBS, vervolgens naar vortex mengen onderwerp. Met behulp van een steriele microbiologische lus, sub-cultuur op MH agar in een rechte lijn. Laat de plaat drogen gedurende 30 seconden, en dan pipet 10 ul van bacteriophage K1E (10 9 plaquevormende eenheden / ml (PFU / ml)) op het midden van de lijn. Incubeer de plaat O / N bij 37 ° C. De volgende dag gaan de plaat voor-bacteriofaag gemedieerde lysis. 5. Beoordeling van de ernst van de ziekte Beoordeel de ziekte ernst van elk dier 4-5 maal daags met de zeven scoresysteem aangegeven in tabel 1. Als een dier scores ≥3 van de 7, onmiddellijk ruimen het dier om het lijden te minimaliseren. Noteer het dier dood. 6. euthanization van pasgeboren ratten en bloedafname Zachtjes houdt het dier in de ene hand, het blootstellen van het hoofd en de nek. Ontsmet de hals van het dier door te vegen met een alcoholdoekje. Ontsmet een grote schaar met behulp van 70% ethanol, voor het spoelen in steriele PBS te sporen ethanol te verwijderen. Zachtjes houden het dier direct boven een petrischaal. Onthoofden de pasgeborene behulp scherpe Surgical schaar, ervoor te zorgen dat het bloed druipt in de petrischaal. Vermijd contact met het hoofd tot besmetting van het bloed met huidflora te voorkomen. Onmiddellijk verzamelen bloed met een steriele pipet en meng met heparine natriumzout bij een concentratie van 20-50 eenheden / ml in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Bepaal het aantal levende bacteriën door seriële verdunning in PBS en uitplaten op MacConkey agarplaten. Bepaal het aantal levensvatbare E. coli K1 door het testen van de gevoeligheid van levensvatbare bacteriën bacteriofaag K1E. 7. Dissection Na onthoofding van de neonatale rat, gebruiken aseptische omstandigheden met accijnzen en het verzamelen van weefsels van belang. Was alle instrumenten (figuur 1) in 70% ethanol en steriele PBS. Reinig de dissectie bord en bevochtig de buik volledig met 70% ethanol. Plaats het lijk op zijn rug en vast aan de dissectie bord door (i) pinning de linker achterpoot aande operatietafel met een steriele naald, (ii) strekken kadaver pinning het recht voorpoot op de operatietafel, (iii) pinning de rechter achterpoot en rechter voorpoot aan de operatietafel. Trek de huid langs de linkerkant van de onderbuik behulp van een tang, en snijd langs de linkerkant van het lijk uit de onderbuik aan het borstbeen met behulp van kleine dissectie schaar. Verleng de excisie over het borstbeen, en vervolgens langs de rechterkant van het lijk van het borstbeen naar de onderbuik met behulp van pincet en kleine dissectie schaar, ervoor te zorgen dat geen van de onderliggende structuren beschadigd zijn. Tot slot, zachtjes naar beneden trekken van de huid flap van het borstbeen naar de onderbuik behulp iris gebogen dissectie tang om het buikvlies bloot. Til voorzichtig het buikvlies met tang en snijd verticaal om de inwendige organen bloot, zodat geen van de onderliggende organen beschadigd. 8. Verzamelenhet maag-darmkanaal Identificeer de maag, dunne darm, blindedarm, colon en mesenteriale lymfestelsel. Verwijder de maag door voorzichtig doorsnijden aan beide kanten, dan plaats in een bijou met 1,6 ml steriel PBS met behulp van een steriel pincet. Doorsnijden de dubbele punt rectum. Trek de hele intestinale massa voorzichtig van het lijk met behulp van dissectie pincet en plaats in een steriele petrischaal. Zorg ervoor dat deze zacht wordt gedaan zodat de intestinale structuur en mesenterische lymfatische structuren niet scheiden. 9. Scheiding van het spijsverteringskanaal en de Mesenteriale lymfestelsel (figuur 2) Giet 30 ml steriele PBS in de petrischaal, zodat het maagdarmkanaal wordt volledig ondergedompeld. Identificeer de centrale massa van het mesenteriale lymfestelsel, en knijp met behulp van fijne dissectie pincet. Identificeer de meest proximale deel van de dunne darm, en knijpen met behulp van fijne dissectie pincet. Trek langzaam de central massa mesenteriale lymfestelsel en de distale dunne darm in tegengestelde richting totdat de twee weefsels volledig gescheiden van elkaar. Deze stappen zorg aan de dunne darm niet worden uitgerekt, aangezien dit voorkomt reproduceerbare verzameling proximale, middelste en distale gebieden. Plaats de mesenteriale lymfestelsel in 300-500 pi steriel PBS en plaats op ijs. 10. Opdeling van het maagdarmkanaal Doorsnijden het spijsverteringskanaal bij de blindedarm naar de dunne darm te scheiden van de colon. Plaats de dikke darm in 300-500 pi steriel PBS en plaats op ijs. Verzamel representatieve weefsel van proximale, middelste en distale gebieden van de dunne darm. Lijn de dunne darm uit het midden-punt. Vervolgens (i) het verzamelen van de laatste 2 cm van het weefsel vóór het caecum de distale dunne darm, (ii) het verzamelen van het weefsel 5-7 cm boven halverwege de proximale dunne darm, en(Iii) het verzamelen van de tissue 3-5 cm onder het midden-punt als het midden dunne darm. 11. Het verzamelen van de lever Identificeer de drie lobben van de lever rat na verwijdering van de maag. Trek lobben weg van de buikholte met fijne dissectie pincet. Verwijder de lever door het snijden van elke bevestiging van de ligamenten met behulp van fijne schaar. Leg de lever in 300-500 pi steriel PBS en plaats op ijs. 12. Het verzamelen van de Milt Identificeer de milt. Trek milt uit de buurt van de maag en maken gebruik van fijne schaar om de gastrosplenic ligament snijden. Plaats milt in 300-500 pi steriel PBS en plaats op ijs. 13. Het verzamelen van de Nieren Identificeer de nieren die zichtbaar wordt aan de achterkant van de buikholte bij verwijdering van het maagdarmkanaal en andere organen. Cut urineleiders en eventuele bevestigen ligamenten uzingen fijne dissectie schaar en nieren te verwijderen met behulp van fijne tang. Verwijder bijnieren en eventuele vettige materiaal (indien er nog aan) met behulp van fijn pincet en dissectie schaar. Plaats beide nieren in 300-500 pi steriel PBS en plaats op ijs. 14. Het verzamelen van de hersenen Na onthoofding, houdt het hoofd in een rechtopstaande positie met behulp van gebogen pincet. Knijp de huid boven op de kop in de lengte met behulp van een andere set van gebogen pincet, en maak een insnijding met behulp van fijne dissectie schaar. Snijd de resterende huid in de buurt van de nek, weer in de lengte met fijne dissectie schaar. Trek de huid in een naar buiten richting met behulp van fijne tang aan beide zijden aan de schedel te onthullen en verwijder de huid flappen met behulp van fijne dissectie schaar. Plaats fijne dissectie schaar in spinale opening en maken een incisie langs de schedel in de richting van het podium. Trek beide delen van de schedel in een naar buiten richting met behulp van fijne tang. Gesneden schedel segmenten te verwijderen. <li> Verwijder hersenen met behulp van een brede tang, met behulp van een opwaartse beweging scheppen van de spinale opening naar het spreekgestoelte. Was de hersenen in PBS tweemaal om geen bloed van onthoofding procedure te verwijderen. 15. Weefsel bewerken en homogenisering Voor experimenten waarbij levensvatbaarheid tellingen of DNA-extractie, plaats weefsels in buisjes die steriele PBS. Onverwijld de aantallen levensvatbare bacteriën door seriële verdunning in PBS en uitplaten op MacConkey agarplaten en bewaar bij -20 ° C met 20% glycerol korte termijn. Voor DNA-extractie, opslag weefsels bij -20 ° C. Voor experimenten waarbij RNA extractie plaats weefsels in geschikte hoeveelheden RNAlater oplossing (10 pl per 1 mg weefsel), dan onmiddellijk bewaren bij -20 ° C voor korte of bij -80 ° C opslag op lange termijn. Voor experimenten waarbij beeldvorming plaats weefsels in 10 ml Methacarn oplossing (60% methanol, 30% chloroform en 10% azijnzuur) en bewaar eent RT (20 – 25 ° C) gedurende 3 weken. Bereken weefsel gewicht ten opzichte van het gewicht van buizen voor en na toevoeging van weefsels. Homogeniseer weefsel met behulp van een homogenisator. Was de homogenisator eenmaal in 70% ethanol en tweemaal in steriel PBS tussen homogenisatie van elk monster. OPMERKING: Methacarn fixatie is wenselijk voor de fixatie van darmmonsters om-mucine gerelateerde mucosale verdediging structuren te behouden; formaline fixatie kan worden gebruikt voor systemische weefsels.

Representative Results

E. coli K1 systemische infectie model beschreven repliceert veel kenmerken van de natuurlijke infectie bij mensen. De bacteriën worden opgenomen, koloniseren het maagdarmkanaal, transloceren in het bloedcompartiment via de mesenterische lymfeklieren voordat zij orgaanspecifieke ziekte geassocieerde ontsteking van de hersenen 24. Belangrijk is dat het model vertoont sterke afhankelijkheidsratio; zoals getoond in figuur 3, twee dagen oude (P2) jonge ratten zijn zeer gevoelig voor invasieve ziekte, maar gedurende een periode van zeven dagen worden de dieren geleidelijk vuurvaste infectie, maar darmkanaal kolonisatie 17 niet gi. Na doorvoer van de plaats van GI kolonisatie het bloedcompartiment kan de bacteriën in bloedmonsters worden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie (figuur 4) alvorens het CNS voorkeur op de choroid plexus 25. In sommige dieren nog uitgebreid invasie van andere belangrijke organen zoalslong, milt en nieren 25. Aantal bacteriën in weefsels kan sterk variëren tussen individuele pups 25 maar wanneer de biologische belasting wordt gescoord als aanwezig of afwezig is er een hoge mate van reproduceerbaarheid bij orgaantransplantatie invasie. Met een nest van 12 pups als een enkele test cohort, power berekeningen met behulp van G * Vermogen Software vastgesteld dat dit steekproefomvang gelijk aan een 98,6% kans op het vinden van een effect op basis van de overleving met behulp van zes dieren uit de cohort en> 99% kans als alle twaalf in aanmerking worden genomen. Het model is daarom geschikt voor de evaluatie van nieuwe agentia die specifiek ontworpen voor de behandeling van neonatale bacteriële infecties en is gebruikt in de procedure om het therapeutisch potentieel van de capsule depolymerase EndoE die selectief de K1 capsule van het bacteriële oppervlak 24-26 verwijdert evalueren. Het kan ook worden gebruikt om gastheer-bacterie interacties te onderzoeken die invloed op de pathogenesis E. coli neuropathogens; binnen deze context het is gebruikt voor studies van E. coli A192PP kolonisatie en verspreiding. Is aangetoond dat E. coli A192PP cellen volharden in het maag-darmkanaal van P2, P5 en P9 pups in grote aantallen; temporele aspecten van kolonisatie in deze drie groepen waren vergelijkbaar (figuur 5) en weerspiegelt het vermogen van de bacteriën om te repliceren en bevolkingsdichtheid in de darm te handhaven. De virulentie van de klinische isolaat A192 werd versterkt door seriële passage in neonatale ratten om weinig of geen redundantie van het gebruik van dieren te garanderen. E. coli A192 gekoloniseerd P2 neonatale ratten met 100% rendement, opgewekt bacteriëmie in 35% van de dieren en produceerde een dodelijk effect in 25% 27. De gepasseerde afgeleide A192PP koloniseert het maagdarmkanaal, produceert bacteriëmie en veroorzaakt sterfte in alle P2 pups. Aldus kan het model worden gebruikt om de virulentie van di onderzoekenfferent K1 stammen met betrekking tot hun vermogen om het centrale zenuwstelsel en andere orgaansystemen binnendringen van de plaats van kolonisatie. In dit verband Pluschke en medewerkers 23 gebruikt een neonatale rat infectiemodel de capaciteit van 95 E. bepalen coli K1 stammen van menselijke oorsprong te bacteriëmie na darm kolonisatie veroorzaken; ze grote verschillen waargenomen in de efficiëntie van zowel kolonisatie en invasief vermogen, ondersteuning van de klonale aard van E. coli K1 neuropathogens. Figuur 1. Materialen voor tissue collectie: (A) met een gewicht van schaal (B) vooraf gewogen buizen die nodig media, (C) operatie tafel, liniaal en naalden te pinnen het dier, (D), 70% (v / v) ethanol en PBS om de weefselverzameling apparatuur steriliseren <strong> (E) weefselverzameltoestel kit met een grote schaar voor onthoofding en scharen en pincetten en messen van verschillende afmetingen en vormen, (F) ijs om de cellen behouden, (G) 70% (v / v) ethanol te steriliseren de operatie tafel en omringt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2. Scheiding van het maag-darmkanaal en de mesenteriale lymfestelsel. (A) Grip de centrale massa van het mesenteriale lymfestelsel met fijne dissectie pincet. (B) Grip het proximale deel van de dunne darm, en trek in tegengestelde richting. (C) het maagdarmkanaal en mesenteriale lymfestelsel zal volledig separate. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Overleving van neonatale rat pups van twee dagen (P2) tot negen dagen (P9) jaar na orale toediening van E. coli A192PP, ter illustratie van de sterke afhankelijkheidsratio van systemische infectie. Elke groep vertegenwoordigt 24 pasgeborenen. Figuur 4. Fluorescentie afbeeldingen E. A192PP coli cellen in een bloedvlek van een P2 pup besmet na orale toediening van bacteriën. De lipopolysaccharide O antigeen op het bacteriële oppervlak was stained met konijn anti-O18 polyklonale antilichaam en Alexa546-geconjugeerd geit-anti-konijn tweede antilichaam. De K1 capsule werd gevisualiseerd met EndoE-GFP reagens. Vrijwel alle bacteriën gedetecteerd in bloedmonsters getoond beschermende K1 capsule. Beelden werden gevangen genomen door Dr Andrea Zelmer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5. E. coli A192PP intestinale kolonisatie na toediening van het bacteriële inoculum. DNA werd geëxtraheerd uit hele darm en E. coli K1 kolonievormende eenheden / g (CFU / g) weefsel bepaald door kwantitatieve PCR (qPCR) gericht op de polysialyltransferase (Neus) gen zoals elders 17 </sup>. LOD: aantoonbaarheidsgrens. Kenmerken Gezond Ongezond Kleur van de huid Roze Pale / Geel Agility (oprichtreflex) Pup keert onmiddellijk op achteruit plaatsing Moeite met het omkeren achterwaartse plaatsing (> 3 sec) of niet kunnen bereiken Zachte druk op de buik Geen geluid Sound of agitatie Maag / melkleiding Zichtbare en wit Niet zichtbaar Temperatuur Warm Relatief koude * Gewicht Gain van 1,5-2 g per dag Geen gewichtstoename of gewichtsverlies Gedrag wanneer geplaatst in kooi Stappen in de richting moeder en begint feeding Kan niet verplaatsen in de richting van de moeder en toont moeite voeden Tabel 1. Zeven-puntensysteem: De eerste drie genoemde scores zijn meestal de eerste tekenen waargenomen. * Pasgeborenen met systemische infectie ervaring verhoogde lichaamstemperatuur (> 2 ° C). Vanwege het gebrek aan flexibiliteit van de dieren naar hun moeder bereiken lichaamstemperatuur kan ongezonde dieren gescheiden van het strooisel worden en koud de blote hand.

Discussion

Het diermodel beschreven gebaseerd op voorafgaand werk dat gericht op de opvallende kenmerken van natuurlijk voorkomende infecties bij mensen reproduceren. Neonatale ratten werden in eerste instantie gebruikt om kind meningitis als gevolg van H. studeren influenzae type b als de soort voldoen aan de belangrijkste criteria voor een robuust model van de infectie. Daarom moet de toegangspoort van het desbetreffende pathogeen weerspiegelen die van de natuurlijke infectie en reproduceerbaar leiden tot gelijkaardige pathologie van voldoende duur om voor therapeutische interventie. De gebruikte technieken niet de toepassing van de procedure beperken en niet bijdragen aan de ziekte uitkomst 20. Het model van H. influenzae meningitis in zuigeling ratten ontwikkeld door Moxon en collega's voldoet aan deze criteria 20; de natuurlijke infectie optreedt na kolonisatie van de slijmvliezen van de bovenste luchtwegen en deze belangrijke functie in de jonge ratten werd nagebootst door andere traumatic instillatie van de bacteriën op de membranen van de neus. Belangrijk is de leeftijdsafhankelijke aard van de infectie werd gerepliceerd in het model.

Dezelfde groep waren ook de eerste die een niet-invasieve E. model ontwikkelen coli K1 NBM in de neonatale rat 22. Pathogeenvrije Sprague-Dawley pups werden gekoloniseerd door het voeren van 10 augustus – 10 oktober bacteriën door middel van een orale maagsonde; het inoculum was dus aanzienlijk hoger dan die welke door ons. Kolonisatie met de drie K1 stammen onderzocht, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) en LH (O75: K1: H3), deed zich voor in een relatief groot deel (48-74%) van de K1-gevoede dieren, maar het aantal gevallen van bacteriëmie, meningitis en mortaliteit waren variabel en aanzienlijk lager dan de tarieven van de kolonisatie. De klonale aard van E. coli K1 experimentele infectie later vastgesteld 23 en het is nu duidelijk dat alleen O18: K1 en, in mindere mate, O7: K1 serotypes kunnenconsequent veroorzaken systemische infectie. Daarom dit onderzoek van de pathogenese van neuropathogenic E. coli K1 waren gebaseerd op het gebruik van de virulente verbeterde O18: K1 stam A192PP. Een vergelijking van E. coli K1 voederen van neonatale ratten door een maagsonde, zoals gebruikt door Glode en collega 22, en een druppeltje voedingswijze zoals die door Achtman de groep 23 bleek buitensporig aantal sterfgevallen met de eerste werkwijze, vrijwel zeker als gevolg van schade op oppervlakken door het mucosale maagsonde. Aangezien de tarieven van de kolonisatie zijn vergelijkbaar met deze twee methoden, is het raadzaam om de minder invasieve methode van het voeden van de bacteriën met behulp van een pipet met een steriele tip te gebruiken, zoals beschreven in deze mededeling.

E. coli stam A192PP gebruikt in onze studies is O18: K1. Het is een meer virulente derivaat van de klinische stam E. coli A192 die oorspronkelijk was hersteld van een patiënt met sepsis 27 </sup>. De verhoogde virulentie van deze stam werd verkregen door seriële passage door neonatale ratten 26. De stam lokt een leeftijdsafhankelijke ernst van de ziekte, met 100% bacteriëmie en mortaliteit bij toediening aan 2 dagen oude dieren 28. Daarentegen 9 dagen oude dieren volledig bestand tegen ziekten. K1-specifieke lytische bacteriofagen kunnen worden gebruikt om onderscheid E. coli K1 van andere E. coli stammen 29. In deze studie moet gevoeligheid van levensvatbare bacteriën bacteriofaag K1E worden gebruikt om (i) Controleer de zuiverheid van de E. coli K1 suspensies bereid worden gevoerd aan de dieren, en (ii) te differentiëren E. coli K1 van andere coliformen om de levensvatbaarheid te berekenen in perianale swabs, bloed en weefselmonsters. Als de kolonie E. coli K1, wordt het gevoelig bacteriofaag K1E lysis zijn en bacteriegroei wordt geremd op de plaats van inoculatie bacteriofaag. Als de kolonie niet E. coli K1, zal be resistent KIE bacteriofaag lysis, en moet er een ruimte van bacteriegroei op de plaats van inoculatie bacteriofaag zijn. Hierbij moet worden bedacht dat diermodellen niet alle functies van de natuurlijk voorkomende ziekte kan reflecteren. Het huidige model kan worden gemodificeerd om de kenmerken van virulentie dan E. neuropathogenic bacteriën onderzocht coli A192PP en variaties in de omvang van de koloniserende inoculum kan worden ondergebracht. Toekomstige toepassingen van de techniek kan onder meer de evaluatie van de broodnodige medicijnen om de aandoening te behandelen en om de details van de gastheer respons op kolonisatie en weefselinvasie ontdekken.

De hier beschreven methode is eenvoudig maar effectief. Single nesten van 10 – 12 pups werden als test- of controlegroepen en dit binnen-nest benadering zorgt voor een hoge mate van reproduceerbaarheid en statistische validiteit. Het is noodzakelijk dat de pups zo snel mogelijk opnieuw in hun natuurlijke moeder na eventuele procedure en nesten dient derhalve niet bestaan ​​uit dieren die in verschillende interventies. Het is belangrijk dat gevoed inoculum verwarmd anders de pups aangeboden cultuur verwerpen. De pups snel een complex microbiota en binnen twee dagen na de geboorte het maagdarmkanaal wordt gekoloniseerd met een uitgebreide lijst van bacteriën uit de gevestigd als de meest voorkomende microben in de baby en volwassen darm phyla. Pups die niet werden gevoed E. coli A192PP niet dragen E. coli K1 in het maagdarmkanaal 17 en dus de bepaling van de tarieven van de kolonisatie is relatief eenvoudig. De Neus gebaseerde qPCR detectiemethode voor kolonisatie E. coli K1 is veel gevoeliger, dat traditionele kweekmethoden en wordt sterk aanbevolen 17.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek G0400268 en MR / K018396 / 1 van de Medical Research Council, en door Actie Medical Research. Verdere ondersteuning werd verleend door het National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedical Research Centre.

Materials

Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK www.harlan.com
E. coli K1 A192PP Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Glycerol  Sigma, UK www.sigmaaldrich.com G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0337
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK www.oxoid.com CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P4417
Ethanol 100% Sigma, UK www.sigmaaldrich.com E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 84020
Prepare 20-50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK www.sigmaaldrich.com R0901
10µl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 320099
Chloroform Sigma, UK www.sigmaaldrich.com C2432
Methanol Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK www.scientificlabs.co.uk SWA1000
Petri dishes Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P5856
30mL Universal Tube AlphaLaboratories, UK www.alphalabs.co.uk CW3890
0.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1405-1500
1.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1415-1000
0.1µl calibrated loops StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points  Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK www.vwr.com USBE4251
25g Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd www.greinerbioone.com N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK www.perkinelmer.co.uk L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK www.infors-ht.com AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke www.ika.com 0003737000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
  2. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
  3. Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
  4. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  5. Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).
  6. Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
  7. Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
  8. Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
  9. Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
  10. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
  11. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
  12. Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
  13. Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
  14. Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
  15. Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
  16. Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
  17. Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
  18. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
  19. Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
  20. Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
  21. Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
  22. Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
  23. Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
  24. Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
  25. Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
  29. Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).

Tags

Neuropathogenic Escherichia ColiNeonatal RatNon-invasive Infection ModelGut-lymph-blood-brain InfectionAge-dependent InfectionE. Coli O18:K1VirulenceMeningeal InvasionCentral Nervous System InfectionPathogenesisTherapeutic InterventionsBacterial Virulence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image