Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

Humana tipo 1 del virus de inmunodeficiencia (VIH-1) de entrada, mediada por las glicoproteínas de la envoltura viral triméricos (ENV) es el primer paso del ciclo infeccioso. Siendo el único antígeno viral expuesto presentado en la superficie de los viriones, la Env trímero provoca anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Como tal, representa un candidato interesante para el diseño inmunógeno de la vacuna. Sin embargo, los ensayos de vacunación con Env en formas solubles o recombinantes suscitó respuestas con sólo una eficacia mínima contra más primaria del VIH-1 aislados de ^1-3. No obstante, la eficacia parcial observada en el ensayo de la vacuna RV144 ⁴ renovado interés en el VIH-1 Env como candidato inmunógeno. Esto fue corroborado por un reciente estudio describiendo que los anticuerpos anti-Env vacuna-suscitó fueron suficientes para generar un cierto grado de protección contra el VIS y el VIH desafía ^5.

Después de ser sintetizada en el retículo endoplásmico, el glycoprote Enven precursora, gp160, experimenta varias modificaciones post-traduccionales que son críticos para su capacidad para alimentar el proceso de fusión viral. El precursor de Env debe doblar correctamente y asociado en trímeros antes de ser escindida en sus gp120 y gp41 transmembrana extra-citoplasmáticos subunidades ^6-10, con interacciones no covalentes que mantienen el enlace con gp120-gp41. La maquinaria de la célula infectada también es en gran medida responsable de glicosilar Env, que comprende aproximadamente 50% de su masa total ^11,12. La compleja estructura resultante permite Env para ser conformacionalmente flexible de ^13,14, mientras que proporciona una metaestabilidad que se piensa para permitir Env para adaptarse y ocultar ciertos epítopos altamente inmunogénicos que de otro modo estar expuestos ^15-19, subrayando la importancia de comprender mejor las diferentes conformaciones muestreada por el trimer Env nativa.

Hasta la fecha, varias técnicas se han desarrollado y utilizado con éxito para estudiar Env ch conformacionalanges. Sin embargo, varían en sus limitaciones, está a menudo restringido a contextos específicos Env. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie o ensayos de inmunoprecipitación utilizando anticuerpos monoclonales específicos de conformación (mAbs), se basan ya sea en moléculas Env solubles o solubilizados monoméricas que se sabe que son inmunogenéticamente diferentes de sus formas triméricas ^20,21. Estudios recientes también sugieren que la escisión afecta conformaciones resultantes Env en la exposición de los epítopos reconocidos principalmente por anticuerpos no neutralizantes ^14,22,23.

A continuación se describe en detalle un método que permite la determinación rápida y fácil de la conformación de celularmente-expresado Env trímeros ^18,24-26. Después de la transfección transitoria de Env en una línea de células adherentes humana la unión de los anticuerpos de Env-específicos se detecta utilizando una reacción de quimioluminiscencia simple. Esta técnica también se puede utilizar para caracterizar la preferencia conformacional de conformación depen-anticuerpos abolladura. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método robusto y altamente flexible de detección.