הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
סוג נגיף כשל חיסוני אנושי 1 כניסה (-1 HIV), בתיווכו של גליקופרוטאינים trimeric הנגיפיים המעטפה (מעטפה) הוא הצעד הראשון של המחזור המדבק. להיות אנטיגן רק נחשף הנגיפי מוצג על פני השטח של virions, trimer מעטפה מעורר נטרול ונוגדנים nonneutralizing. ככזה, הוא מייצג מועמד מעניין לעיצוב immunogen החיסון. עם זאת, ניסויי חיסון עם מעטפה בצורות מסיסה או רקומביננטי עוררו תגובות עם יעילות מינימאלית בלבד מול רוב HIV-1 העיקרי מבודד 1-3. עם זאת, יעילות חלקית נצפתה בעניין ניסוי בחיסון RV144 4 המחודש בנגיף HIV-1 מעטפה כמועמד immunogen. זה אושר על ידי מחקר שנערך לאחרונה מתאר כי נוגדנים נגד מעטפה-הושר חיסון היו מספיק כדי ליצור מידה מסוימת של הגנה מפני SIV ו HIV מאתגר 5.
לאחר שמסונתז בreticulum endoplasmic, glycoprote מעטפהבמבשר, gp160, עובר לאחר translational שינויים שונים שהם קריטיים ליכולתה כדי לתדלק את תהליך היתוך ויראלי. מבשר מעטפה חייב לקפל כראוי ושותף בtrimers לפני שהבקיע ליחידות משנת gp120 וgp41 הטרנסממברני במיוחד cytoplasmic 6-10, עם אינטראקציות noncovalent שמירה על קשר gp120-gp41. מכונות התא נגועות היא גם אחראיות לglycosylating כבדות מעטפה, הכולל כ -50% מהמסה הכוללת שלה 11,12. המבנה המורכב וכתוצאה מכך מאפשר מעטפה להיות conformationally גמישה 13,14, תוך מתן-חלקית, כי הוא חשב על מנת לאפשר מעטפה להסתגל ולהסתיר אפיטופים חיסוניים מאוד מסוימים שאחרת היה חשוף 15-19, המדגיש את החשיבות כדי להבין טוב יותר את התצורות השונות נדגמו על ידי trimer מעטפה הילידים.
נכון להיום, כמה טכניקות פותחו ומשמשות בהצלחה ללמוד ch קונפורמציה מעטפהAnges. עם זאת, הם משתנים במגבלות שלהם, שלעתים קרובות מוגבלים להקשרי מעטפה ספציפיים. לדוגמא, תהודת plasmon פני השטח או מבחני immunoprecipitation באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים קונפורמציה (בז), להסתמך גם על מולקולות מסיסה או solubilized monomeric מעטפה אשר ידוע להיות שונה immunogenetically מצורות trimeric 20,21. מחקרים שנעשה לאחרונה מראים גם כי מחשוף משפיע תצורות מעטפה וכתוצאה מכך החשיפה של אפיטופים מוכרים בעיקר על ידי nonneutralizing נוגדנים 14,22,23.
כאן אנו מתארים בפירוט שיטה המאפשרת לקביעה מהירה וקלה של קונפורמציה של trimers מעטפה הביעה cellularly 18,24-26. בעקבות transfection החולף של מעטפה בשורת תאים חסיד אנושית המחייב של נוגדני מעטפה ספציפיים מזוהה באמצעות תגובת chemiluminescence פשוטה. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין את העדפת קונפורמציה של קונפורמציה-depenנוגדני שקע. לפיכך, assay זה מספק שיטה לגילוי חזקה וגמישה מאוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
assay זה הוא מותאם כדי לזהות את האינטראקציה של בז ספציפי עם HIV-1 מעטפה trimeric הביעה על פני התא. ברגע שהפרוטוקול כבר נקבע, ניתן להשתמש בו במדיום לתפוקה גבוהה עם עלויות נמוכות הכוללות חומר וכמויות קטנות של נוגדנים. מאז assay זה הוא מבוסס transfection, זה יכול בקלות להיות מותאם לcoexpression …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ג'יימס רובינסון למתנתו הנדיבה של A32, 17b, 48d, וC11 מהבז. PGT 121 הושג באמצעות התכנית מגיב NIH האיידס, החטיבה של איידס, NIAID, NIH (חתול # 12343). עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות תכנית המנהיג # 29,866, על ידי ההפעלה CIHR # 257,792, על ידי הקמת FRQS של מדען צעיר להעניק # 24,639 לAF ועל ידי מענק רצף CRCHUM כמו גם על ידי מענק # זרז CIHR 126,630 לAF וMR. AF הוא הנמען של # 24,639 אחוות 1 FRSQ Chercheur Boursier Junior. MV נתמכה על ידי # CIHR דוקטורט פרס מחקר 291,485.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
