Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection
Summary
Этот протокол представляет собой эффективный и надежный способ для трансфекции человека ТНР-1 макрофагов с миРНК или плазмидной ДНК путем электропорации с высокой эффективности трансфекции, сохраняя при этом высокую жизнеспособность клеток и макрофагов полный потенциал для дифференциации и поляризации.
Abstract
Макрофаги, как ключевых игроков врожденного иммунного ответа, являются в фокусе исследований, касающихся использования тканевого гомеостаза или различных патологий. Трансфекцию с миРНК и ДНК плазмиды является эффективным инструментом для изучения их функции, но трансфекции макрофагов не тривиальный вопрос. Хотя много разных подходов для трансфекции эукариотических клеток имеются, лишь немногие позволяют надежной и эффективной трансфекции макрофагов, но снижение жизнеспособность клеток и сильно измененное поведение клеток, как уменьшенной способности к дифференциации или поляризации часто наблюдается. Поэтому протокол трансфекции требуется, что способен передавать миРНК и плазмидной ДНК в макрофаги, не вызывая серьезные побочные эффекты, тем самым позволяя исследование эффекта от миРНК или плазмиды в контексте нормальное поведение клеток. Протокол, представленные здесь, относится к способу надежно и эффективно трансфекции человека ТНР-1 макрофагов и Моnocytes с высокой жизнеспособности клеток, высокой эффективности трансфекции, и минимальное воздействие на поведение клеток. Этот подход основан на Nucleofection и протокол был оптимизирован для обеспечения максимальной возможности для активации клеток после трансфекции. Протокол является достаточным для адгезивных клеток после отрыва, а также клеток в суспензии, и может быть использован для малых и средних чисел выборок. Таким образом, метод, представленный полезен для изучения генных регуляторных эффектов во время макрофагов дифференциации и поляризации. Помимо представления результатов, характеризующих макрофаги трансфектированных соответствии с этим протоколом в сравнении с альтернативным методом химической, также обсуждается влияние культуры клеток Выбор среды после трансфекции на поведение клеток. Представленные данные указывают на важность проверки выбор для различных экспериментальных условиях.
Introduction
Среди клеточных компонентов иммунной системы человека, макрофаги имеют большое значение для врожденного иммунного ответа. В их задачи разнообразны; они участвуют в фагоцитозе патогенов и некротического материала, они играют важную роль в гомеостазе ткани и продуцируют и секретируют большое количество цитокинов, чтобы регулировать и организовать иммунного ответа 1. Поэтому макрофаги как единое участвует во многих физиологических процессов и патофизиологических условиях. В связи с разнообразием своих задач, макрофаги являются очень неоднородна и многогранна тип клеток. Это достигается за счет различной поляризации; в зависимости от внешних раздражителей макрофагов может перерасти в различных фенотипов 2. Изменчивость макрофаги "и влияние на иммунный ответ сделать их очень интересный предмет исследования. Для того чтобы выяснить их сложную метаболические и регуляторные функции, соответствующий макрофагов в моделях пробирке являются Требуеuired которые правильно отражают макрофагов неоднородность и изменчивость.
Трансфекции клеток векторов плазмидной ДНК или малых интерферирующих РНК (миРНК), чтобы изменить выражение клеточного гена стал широко используемым и мощный инструмент в клеточной биологии для исследования как регуляции генов и функции гена. В настоящее время существует большой выбор различных инструментов, доступных для трансфекции эукариотических клеток. Эти инструменты включают в себя применение вирусных векторов, механических методов (например, генов орудий), на химических подходов (которые полагаются на полимеры или липиды, которые могут образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами), и электропорации клеток 3. Все эти подходы имеют свои преимущества и недостатки, и выбор лучше всего подходит из этого широкого спектра для определенного типа клеток и применения может быть трудной и длительный процесс,.
Макрофаги как известно, трудно трансфекции как почти все устоявшиеся transfeие подходы резко сократить жизнеспособность макрофагов »или вмешиваться в их поведении, т.е. дифференциации и, в частности поляризации. Поэтому, мы представляем здесь эффективную, невирусный протокол для трансфекции человека THP-1 макрофагов с помощью электропорации основе технологии Nucleofector, которая представляет собой оптимизированный электропорации подход, требующий уменьшенные количества ДНК. Nucleofection хорошо подходит для чувствительных клеток, таких как моноциты и макрофаги. Этот протокол является адаптацией ранее опубликованных версий 4,5.
Вкратце, форбол 12-миристат-13-ацетата (РМА) используется для различения человека ТНР-1 моноцитов в течение 48 ч в недоношенных макрофагов до трансфекции с миРНК или плазмидной ДНК. Для трансфекции predifferentiated макрофаги отдельно ферментативно обработкой Accutase I. Трансфекцию проводили с использованием устройства 2b Nucleofector для электропорации клеток. После трансфекции, отличаетсяentiation продолжают в течение еще 24 до 48 часов по мере необходимости. И, наконец, зрелые макрофаги, трансфицированные инкубируют с различными видами соединений для функциональных исследований.
Такой подход позволяет трансфекции клеточных линий, таких как человека THP-1 моноцитов и макрофагов и успешно применяется в прошлом 6-10. В отличие от большинства подходов химической трансфекции, наша изменение процедуры Nucleofection с помощью преждевременных макрофаги дает высокую эффективность трансфекции в сочетании с ненарушенной жизнеспособности клеток, без необходимости использовать вирусные векторы или добавить дополнительные соединения, несущие с неизвестными побочными эффектами. Кроме того, макрофаги сохраняют свой потенциал для дифференцировки, а также поляризацию таким образом позволяя беспрепятственно функциональных исследований после трансфекции 11.
Кроме того, среда для культивирования клеток применяется после Nucleofection сильно влияет функциональных исследований следующую транзакциюsfection; в частности, способность макрофагов »для поляризации может зависеть от приложенного культуральной среды. Здесь четыре различных типа для культивирования клеток (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 и мышь T Cell Nucleofector среднего) были испытаны в дезактивирующих условиях с использованием интерлейкина (ИЛ) 10. Использование ТНР-1 макрофагов, мы обнаружили, что клетки отзывчивость на IL10 является сильнее, когда мышь Т-клеток Nucleofector среда используется в сравнении с другой культуральной среде, упомянутых выше. Эти результаты показывают, что необходимости оптимизации всех условиях культивирования клеток имеет важное значение для успешной трансфекции унд последующих функциональных исследований, так как они могут значительно улучшить результаты эксперимента.
Как макрофаги участвуют в различных человеческих заболеваний, гораздо исследования направлены на выяснение макрофагов поведение, а также регулирующим механизмы, влияющие макрофаги или, в свою очередь, контролируемые макрофагов. Таким образом, этот протокол имеет прямое отношениемного различных научные направления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описано здесь, представляет собой надежную и эффективный способ для трансфекции ТНР-1 макрофаги, которые, как правило, довольно трудно трансфекции. Трансфекция может быть достигнуто с эффективности трансфекции выше 90% в течение миРНК без значительного снижения жизнеспособности клеток. Эффективность для плазмид может быть меньше за счет их размера, но трансфекции КПД около 70% может быть, как правило, достигнутых. Эффективность миРНК опосредованного нокдауна может достигать от 80 до 90% в зависимости от приложенного миРНК. Основным преимуществом этого протокола является то, что он не мешает дифференциации клеток. После трансфекции клетки еще нормально реагировать на дифференциации агента PMA (рис 1А 1Б и рисунок 4) 12. В капельную сотовой поляризации цитокинов стимулы, такие как LPS или IL10 / IFN, не зависит 12, хотя это также сильно зависит от среды, выбранной для выращивания после трансфекции аы показано на рисунке 4.
Есть несколько вариантов, в рамках процедуры, которая может быть изменена, чтобы приспособить протокол к конкретным требованиям. Как показано на фиг.4, клетки-разному реагируют на той же IL10 стимула в зависимости от культуральной среде, выбранной после трансфекции. Это показывает, что носитель композиция имеет сильное влияние на клеточном поведения. Поскольку эффект введенного среды могут отличаться для различных экспериментальных стимулов, вполне возможно, что оптимальная среда может измениться и, следовательно, существует необходимость проверить пригодность среды для различных экспериментов независимо. Однако RPMI-1640, который является средней по умолчанию используется для выращивания клеток ТНР-1, оказалась плохо подходит для выращивания после трансфекции как это наблюдалось значительная потеря в клеточной жизнеспособности. Кроме того, протокол также может быть применено к ТНР-1 моноцитов без предварительного РМА-индуцированной дифференциации этогоОчевидно, устраняет необходимость для открепления клеток во время процедуры, но все остальные шаги не должны быть скорректированы. Моноциты ТНР-1 могут быть дифференцированы после этого, если необходимо.
Наиболее важными элементами протокола, во-первых отряд и вторых время, необходимое для трансфекции. Отделение должно быть выполнено как можно более осторожно, чтобы сохранить высокую жизнеспособность клеток. Поэтому мы рекомендуем сравнительно мягкий ферментативную отряд по Accutase I над довольно агрессивные методы, такие как трипсинизации. Дальнейшие отряд методы, такие как лечение лидокаин или выскабливание оказались весьма вредно и не должны использоваться. В случае, 30 мин лечения Accutase я не должен быть достаточным, чтобы снять все клетки правильно это обычно признак неправильно хранится или истек решения Accutase I или слишком много циклов замораживания-оттаивания. Мы получили хорошие результаты, сохраняя небольшие аликвоты Accutase I при -20 °С уменьшить количество циклов замораживания-оттаивания. Однако при недостаточном отряд либо заменить Accutase я с пресной Accutase или увеличить время инкубации до 1 часа. В дополнение нежным разговоров или ополаскивания колбы или пластины могут помочь отряд. Что касается необходимого времени для трансфекции время экспозиции клеток с чистым раствором Nucleofector получил большое влияние на выживаемость клеток и, таким образом, должны быть как можно короче. Лучший способ добиться этого для выполнения каждой трансфекции в то время (этапы 2,10 до 2,15) и не нескольких трансфекций параллельно.
Если нокдаун эффективность низка, это, как правило, не связана с низкой эффективностью трансфекции, но это можно легко проверить с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии и флуоресцентную метку миРНК или кодирования GFP плазмиды. Небольшая причиной является неэффективная миРНК или ДНК плазмиды. В этих условиях следует учитывать, чтобы увеличить количество миРНК (до 2-3 мкг), либоплазмидной ДНК (до 1-2 мкг), либо использовать другой миРНК или вектор экспрессии, если доступно. Кроме того, удовлетворительные результаты могут быть также достигнуты с помощью пул нескольких различных киРНК, направленных против той же цели. Кроме того, эксперименты курс времени может потребоваться, чтобы точно определить период максимального эффекта, который обычно достигается после того, как от 24 до 72 ч после трансфекции.
Кроме трансфекции методом электропорации есть еще и установленные методы трансфекции клеток млекопитающих. Часто применяемые системы химических агентов трансфекции, которые могут образовывать комплексы с грузовой нуклеиновой кислоты, а затем облегчить транспортировку в клетки. Наиболее часто используемые реагенты либо на основе различных видов липидов или может быть выбран из числа катионных полимеров 3. Для обоих подходов разнообразный выбор имеется в продаже. Эти трансфекции реагенты имеют преимущество, что они, как правило,простой в использовании, не требует много времени, и работать с прикрепленных клеток, а, тем самым устраняя необходимость отряда. К сожалению, макрофаги довольно трудно для трансфекции с помощью этих методов, поскольку они существенно не пролиферируют в пробирке и обладают защитные механизмы, направленные против внешней цитозольного ДНК 13-15. Таким образом, химическое трансфекции подход часто приводит к резкому сокращению жизнеспособности клеток. Тем не менее, как показано на рисунке 2, существуют химические агенты трансфекции, которые могут успешно переносить миРНК в макрофаги, а также проточной цитометрии (Фиг.2А) и флуоресцентной микроскопических (2В) анализ показывают, что они не в состоянии достигнуть того же равномерное распределение миРНК в клетках, как получен Nucleofection. В самом деле, данные проточной цитометрии показали, что две различные популяции клеток, трансфицированных происходит, в первую очередь с населением с аналогичным флуоресценции в клетках после Nucleofectiна обнаружении и вторых есть население с более интенсивную флуоресценцию. Определенный подтверждение все еще требуется, но мы предполагаем, что первый население в флуоресцентной микроскопии идентичной с тех клеток, которые показывают равномерное распределение флуоресцентного миРНК в пределах цитозоле а вторая население всего соответствует клеток с очень яркими агломераты. Данные Цитометрический показанные на рисунке 2А предположить, что результаты nucleofection в меньшей миРНК на клетку, чем альтернативный подход липофекции. Однако данные на фиг.3 показывает, что даже сравнительно небольшое количество миРНК включены Nucleofection уже достаточно для 80 до 90% нокдауна гена-мишени. Поэтому дополнительное количество миРНК включены второй населения после химической трансфекции весьма вероятно, профицит и, таким образом, скорее всего, причиной нежелательных побочных эффектов, чем на дальнейшее повышение эффективности нокдаун. Кроме тогоформирование внутриклеточных агломераты уже нежелательно само по себе, так как эти молекулы миРНК, скорее всего не работает или, по крайней мере, менее эффективны, чем свободных молекул миРНК и может привести от целевых эффектов. Кроме истинная природа этих агломератов пока не ясно. Вполне возможно, что эти яркие пятна представляют эндосомы, указывающие, что миРНК был усвоен клеток, но впоследствии освободить от эндосомах не удалось, и миРНК остается в ловушке, и поэтому неэффективны. В качестве альтернативы пятна может быть агломераты, которые образуются внутри клеток. Функциональные оценки химической трансфекции находятся на рассмотрении, поэтому нет окончательных заявлений по бросовой эффективности не могут быть сделаны не менее, до сих пор существование двух различных популяций уже неблагоприятными, так как это означает, что все результаты описывают среднее обеих группах, это, следовательно, не соответствуют либо из популяций. По этой причине Nucleofection является более предпочтительным решением.
<p clзадницу = "jove_content"> Тем не менее есть и ограничения на процедуры трансфекции, описанной здесь. Поскольку клетки должны быть в виде суспензии Nucleofection прилипшие клетки должны быть отделены, который представляет собой дополнительный фактор напряжения к клеткам. Кроме того, вся протокол, а отнимает много времени. Поскольку трансфекции не может быть выполнена одновременно, но должны быть выполнены быстро, чтобы избежать повреждения клеток, количество образцов ограничено до примерно 8 – 10 в эксперименте. Таким образом, этот протокол не подходит для высокой пропускной скрининга проектов. Для применения при высоких пропускной различные системы Nucleofector доступны. Во-первых, существует система 4D-Nucleofector что предлагает формат полосы 16 а. Для еще большего пропускной способности, есть система Shuttle 96 хорошо и 384 также система HT Nucleofector. Однако, поскольку эти новые системы работают с проводящими полимерными электродами вместо алюминия и поэтому электрических условиях, то есть программ и COMPOSсуперпозицию раствора Nucleofector, были изменены соответствующим образом, она должна быть определена, если наш протокол может быть переведен в этих системах.Тем не менее, несмотря на эти ограничения протокол, представленный здесь действительно поддается надежной и эффективной трансфекции клеток ТНР-1, который превосходит все другие невирусных подходов. Этот протокол позволяет производить исследование последствий выражения измененного гена в ТНР-1 клеток, которые во всех других аспектах дифференцируются и поляризовать нормально и, таким образом, показать, как маленькие побочные эффекты трансфекции, как это возможно.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Lonza Group ООО за организацию этого издания, покрывая расходы на публикацию. Мы благодарим Deutsche Infarktforschungshilfe, Вильгельма Vaillant-Stiftung, Эрнест-Solvay-Stiftung, и тюрингер Ministerium für Bildung, Wissenschaft унд Kultur для финансовой поддержки SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
- Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
- Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
- Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
- Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
- Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
- Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
