Muscle sensoriske nevroner er involvert i proprioceptor signalisering og også rapportere om metabolske tilstand og skaderelaterte hendelser. Vi beskriver en voksen mus in vitro muskel-nerve forberedelse for studier på elastiske-aktivert muskel afferenter.
Muscle sensoriske nevroner innervating muskel spindler og Golgi seneorganer kode lengde og tvinge endringer avgjørende for propriosepsjon. Ytterligere afferente fibre overvåke andre kjennetegn ved muskel miljø, inkludert metabolitt oppbygging, temperatur og nociceptive stimuli. Generelt kan unormal aktivering av sensoriske nevroner føre til bevegelsesforstyrrelser eller kroniske smertesyndromer. Vi beskriver isolering av extensor digitorum longus (EDL) muskel og nerve for in vitro studie av stretch-fremkalt afferente responser i den voksne mus. Sensorisk aktivitet er registrert fra nerve med suge elektrode og individuelle afferenter kan analyseres ved hjelp pigg sortering programvare. In vitro forberedelser tillate godt kontrollerte studier på sensoriske afferenter uten de potensielle confounds av anestesi eller endret muskel perfusjon. Her beskriver vi en protokoll for å identifisere og teste responsen av muskel spindel afferenter å strekke. Viktigere,dette preparatet støtter også studiet av andre subtyper av muskel afferenter, responsegenskaper etter legemiddel søknad og inkorporering av kraftige genetiske tilnærminger og sykdomsmodeller i mus.
Skjelettmusklene innerveres av sensoriske nevroner som gir sentralnervesystemet med viktig informasjon om muskel miljø. Muskel spindler er høyt spesialisert innkapslet strukturer sammensatt av intrafusal muskelfibre som er plassert parallelt med extrafusal muskelfibre. Spindler innerveres av konsernet Ia og II afferenter som koder endringer i muskellengde og intrafusal fiber tone er dynamisk regulert av innervating gamma motor nevroner en. Gruppe Ib afferenter er plassert mellom muskelfibre og deres sene innsettinger og er følsomme for endringer i muskelstyrke, for eksempel under muskelkontraksjon to. Konsernet Ia, Ib og II afferenter gir proprioseptiv tilbakemeldinger som bidrar i riktig motorisk kontroll. Andre populasjoner av muskel afferenter som ligger over hele muskelen (Gruppe III og IV) tjener til å signalisere metabolitt oppbygging, tilstedeværelse av nociceptive stimuli, og muskeltemperaturen <sup> 3. Denne muskel sensorisk informasjon er kritisk for å opprettholde homeostase og hindrer muskelskader og modulerende bevegelse. Muscle afferenter kan endre sine avfyring mønstre basert på tidligere erfaring fire. Aktivering av nociceptors kan føre til induksjon av kroniske smertetilstander 5 og avvikende signal fra muskel proprioceptors kan føre til problemer med balanse eller bevegelse seks. Vi bruker en isolert muskel-nerve in vitro forberedelse til å studere responsen av muskel sensorisk nevron reseptor avslutninger fra voksen mus av begge kjønn (vises er svar 2-4 måneder gamle C57BL / 6 mus). Musen er modellen genetisk arter for studier i pattedyr. Fremstillingen krever isolasjon av dyp peroneale gren av isjiasnerven og extensor digitorum longus (EDL) muskel, en hurtig rykk muskel av peroneale gruppe som finnes i den laterale delen av leggen. EDL er ofte brukt for å studere muskel kontraktile egenskaper 7-9, har tendons som er lett å isolere og er liten nok til å tillate tilstrekkelig diffusive oksygentilførsel i ro og med rimelige sammentrekning plikt sykluser 10. Andre muskler i dette området (for eksempel soleus og tibialis anterior) er av samme størrelse og dette preparatet kan enkelt endres til å ta opp fra afferenter fra disse musklene. En suge elektrode er plassert på den avskårne enden av nerve til å ta opp muskel sensorisk afferent avfyring. Individuelle nevroner kan identifiseres og analyseres basert på deres pinneform ved hjelp av pigg sortering programvare. Stimulering av elektrodene i badet eller på nerve kan brukes til å fremkalle muskelkontraksjon. Muskel lengde og styrke kan kontrolleres og måles ved hjelp av kommersielt tilgjengelige systemer. Lignende in vitro-forberedelsene har vært brukt i gnagere for å studere gruppe III og IV muskel afferenter i rotte EDL 11 Gruppe Ia og II spindel afferenter i rotte fjerde lumbrical tå muskel 12 og gruppe III og IV muskel afferenter i than muse plantar muskel 13.
En in vitro-system har fordelene av farmakologisk tilgjengelighet og direkte kontroll av perfusatet og fysio variabler som temperatur og pH. En in vitro metode eliminerer den potensielle in vivo confounds av anestesi og muskel perfusjon status. Mens muskel-nerve preparatet gjør det mulig for studiet av den direkte reaksjon av en forstyrrelse på afferenter, evnen til å studere gamma efferente modulering av spindelen sensitivitet og andre integrerte responser som er mulig med in vivo 14 eller ex vivo tre preparater som er ofret det er ingen nervecellene i dette preparatet.
Dette preparatet ble tidligere brukt for å karakterisere responsen muse muskel spindel afferenter til et batteri av rampe og hold strekninger og vibrasjoner, og det ble fastslått at mus spindel afferente responses var lik de som er rapportert i andre arter som rotter, katter og mennesker. Muse spindel afferente svar ble funnet å være lik på både 24 ° C og 34 ° C badetemperaturer, selv på 34 ° C absolutte avfyring priser var raskere og afferenter var mer i stand til å svare på raskere lengde endres 15. Vi beskriver nedenfor hvordan dette preparatet kan brukes til å identifisere og studere muskel spindel afferenter. Videre kan dette preparatet lett kan modifiseres for å undersøke responsen av andre muskel afferente subtyper 13, for å sammenligne egenskapene til sensoriske afferenter i respons til et medikament eller sykdomstilstand, eller diverse andre variabler (f.eks, alder, kjønn, genet knockout).
Målet med denne artikkelen var å beskrive en metode for opptak fra muskel spindel afferenter i en isolert mus muskel-nerve forberedelse. Vi har funnet at mus spindel afferenter reagere på samme måte for å strekke seg så de fra rotter, katter og mennesker 15 og andre laboratorier har brukt mus som modellorganismer for å studere sensoriske nevroner i både muskel og hud in vitro (for eksempel 3,13) .
Muskelen sensoriske afferenter kan tas opp i minst 6-8 timer ved både 24 ° C og 34 ° C. For å minimalisere håndtering EDL og nerve, bruke den gjenværende delen av FHL å håndtere vevet når det er mulig. Etter disseksjon, venter i minst 1 time for å starte datasamling for å tillate vevets til likevekt ved temperaturen i badet og for normal synaptisk transmisjon for å komme seg. Tidligere ble muskel helse bekreftet på en undergruppe av musklene som brukes i dette preparatet ved å bestemme at den maksimale tetanic contractile kraft generert av musklene er lik den som er rapportert av andre ved begynnelsen og slutten av forsøket 15.
Muskelen spindel afferenter ble identifisert funksjonelt i dette preparatet ved å se etter en karakteristisk pause i avfyring i respons til twitch kontraksjon (figur 2), så vel som de forventede øyeblikkelige frekvens økninger i respons til endringer lengde (figur 3). I vår erfaring, de fleste afferenter som ild i kontroll forholdene er muskel spindel afferenter. Lengden av nerve beholdt i dette preparat (~ 7 mm maks) ikke er lang nok til å bruke afferente ledningshastighetsforskjeller for å identifisere muskel afferente subtyper 13. I tillegg, i motsetning til i katter og mennesker, tiltak av dynamisk følsomhet var ikke i stand til å tydelig skille Gruppe Ia og II afferenter i mus (for videre diskusjon se Wilkinson et al. 15). Andre undertyper av afferenter (dvs.., Gruppe III og IV) kan identifiseres ved hjelp av ytterligere funksjonelle tester i dette preparatet, for eksempel ved å tilsette stoffer som capsaicin, ATP, eller bradykinin, avtagende pH-bad, utsette muskel til iskemi, etc. 3,13,21-23 Ved hjelp av sugeelektrodene tillater aktivitet fra flere sensoriske nevroner som skal tas opp på en gang, noe som øker mengden av data som kan bli samlet fra en enkelt muskel. Dette preparatet kan benyttes for å måle den totale effekt av en perturbasjon i sensoriske nevroner i respons eller responsene identifiserte afferenter. Hvis spike figurer er unikt nok, kan opptil fire sensoriske nevroner bli diskriminert av programvare (både Spike2 (Cambridge Electronic Design) og LabChart Pro (AD Instruments) har utført på samme måte). I tilfeller hvor nerveceller ikke kan bli diskriminert, kan endringer i plassering av elektrodene eller tips diameter lett implementeres.
I sammendraget, musen muskel-nerve in vitro preparasjon er en enkel eksperimentell tilnærming som kan brukes til å undersøke respons egenskapene til muskel sensoriske afferenter til ulike fysiokjemiske forstyrrelser, skader og sykdomsmodeller. I tillegg er dette preparatet ideell for å dra nytte av de kraftige genetiske verktøy tilgjengelig hos mus, inkludert transgene dyr og optogenetic verktøy.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |