一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

ニューロンは、高度が長く、多くの場合、非常に精緻化プロセスの確立及び神経回路の構造および機能を維持するための基本である細胞を分極されている。軸索はシナプスとの間で貨物を運ぶ重要な役割を果たしている。細胞体で合成されたタンパク質および細胞小器官は、神経機能をサポートするために、シナプス前末端に到達するために軸索を通って輸送される必要がある。これに対応して、遠位軸索で受信された信号は、形質導入し、細胞体に搬送する必要がある。これらのプロセスは、ニューロンの生存、分化および維持に必須である。いくつかのニューロンにおけるその軸索輸送が距離を通って1000倍以上細胞体の直径を行わなければならないでは、可能性は容易に小さくても赤字は著しく、神経回路機能に影響を与える可能性があることが想定される。

脳由来神経栄養因子（BDNF）、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ミリアンペアで存在する海馬、大脳皮質、および前脳基底核を含むニューヨークの脳領域、。 BDNFは、認知回路に関与するニューロンの生存、分化、および機能をサポートすることによって、認知および記憶形成において重要な役割を果たしている。 BDNFは、それがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（MAPK / ERK）、ホスファチジルイノシトール3 – キナーゼを含むのTrkB媒介性シグナル伝達経路を活性化する軸索末端に、その受容体、チロシンキナーゼのTrkBに結合する（PI3K）およびホスホリパーゼC-ガンマ（PLCγ）。これらのシグナル伝達経路に関与するタンパク質を、逆行性神経細胞の細胞体に輸送され、エンドソーム^{1-6シグナリング} BDNF / TrkBのを形成するために、エンドサイトーシス小胞構造にパッケージ化されています。

マイクロ流体培養チャンバーは、通常の条件下でだけでなく、怪我や病気^7,8の設定で軸索生物学を研究するための非常に便利なプラットフォームです。軸索を分離することにより細胞体から、デバイスは、1つの軸索^8-10で特異的に輸送を研究することができました。本研究で用いた450μmでマイクログルーブの障壁とPDMSベースのマイクロ流体プラットフォームは、商業的に（材料の表を参照）から購入した。 BDNF輸送を調べるために、モノビオチン化BDNF（mBtBDNF）を生成するための新規な技術を開発しました。私たちは（またAviTagをとして知られている）のビオチンアクセプターペプチドは、APを利用しました。これは、特に、大腸菌酵素ビオチンリガーゼ、BirAをすることによって、ビオチンに連結することができるリジン残基を含む15アミノ酸配列である。私たちは、PCR（ 図1A）、マウスプレproBDNF cDNAのC末端にAviTagを融合。構築物は、哺乳動物発現ベクター、をpcDNA3.1 mycを、彼のベクターにクローニングした。またをpcDNA3.1のmyc彼のベクターに細菌のBirA DNAをクローン化した。二つのプラスミドを一過両方のタンパク質を発現させるためにHEK293FT細胞に同時トランスフェクトした。 BirAをはビオのライゲーションを触媒するモノビオチン化BDNFモノマーを製造するために：1の比率、特にリジンの1でBDNFのC末端にAviTagを内に存在する。 〜18 kDaの分子量を有するビオチン化、成熟BDNFをNi-樹脂（ 図1C）を用いて培地から回収して精製した。イムノブロッティング（ 図1D）で修正されていないBDNFを検出することができないことによって判断されるようにBDNFのビオチン化は、完了した。ストレプトアビジン共役量子ドット、量子ドット655は、QD-BDNFを作るためにmBtBDNFを標識するために使用された。 mBtBDNFは、リン酸化のTrkB（ 図1E）を活性化し、組換えヒトBDNF（rhBDNF）程度に神経突起伸長（ 図1F）を刺激することができたとしてAviTagをの存在は、BDNFの活性を妨害しませんでした。免疫染色は、QD-BDNFはQD-BDNFは、生物活性（ 図1G）であることを示す、海馬軸索でのTrkBと共局在することが示さ。 BDNF輸送を研究するために、QD-BDNFは、遠位軸索区画に添加したラットE18海馬ニューロン（ 図2A）を含むマイクロ流体文化。軸索内のQD-BDNF逆行性輸送を赤色蛍光タグ（ 支援動画S1、S2）のリアルタイムライブイメージングによって捕獲された。生成されたカイモグラフを分析することによって、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒（ 図3A）の移動速度で逆行性に輸送されることが観察された。 GFPまたはmCherryをタグ付きBDNFは、BDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。主な欠点は、それらが単一分子研究のための十分に明るいではないということです。また、順行性および逆行性BDNFの動きの両方の存在は、それが困難な逆行性輸送BDNFは、ニューロトロフィン/受容体複合体にあったかどうかを評価することができる。

このビデオでは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内にQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証する。 ultrabrightnessと量子ドットのMAKの優れた光安定性エスことが可能BDNF輸送の長期的な追跡を実行する。これらの技術は、AD、HD、および他の神経変性疾患において、軸索機能の研究を強化するために利用することができる。