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Biologie

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testis y individuales masculinos quistes línea germinal: Disección, Imaging y Tratamiento farmacológico

Published: September 11, 2014
doi:
10.3791/51868
, , ,
1Fachbereich Biologie, Entwicklungsbiologie,Philipps-Universität Marburg, 2Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung,Philipps-Universität Marburg

Summary

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Abstract

Durante la espermatogénesis en los mamíferos y en Drosophila melanogaster, las células germinales masculinas se desarrollan en una serie de procesos de desarrollo esenciales. Esto incluye la diferenciación de una población de células madre, amplificación mitótico, y la meiosis. Además, las células germinales post-meióticas se someten a un proceso de remodelación morfológica dramática, así como una reconfiguración epigenética global de la cromatina el interruptor de línea germinal-histona-a la protamina.

Estudiar el papel de una proteína en la espermatogénesis post-meiótica usando mutagénesis u otras herramientas genéticas es a menudo impedida por embrionario esencial, pre-meiótica, o meióticas funciones de la proteína bajo investigación. El fenotipo post-meiótica de un mutante de una proteína de este tipo podría ser oscurecida a través de un bloque de desarrollo anterior, o la interpretación del fenotipo podría ser complicado. El organismo modelo Drosophila melanogaster ofrece un bypass a este problema: testículos intactos yincluso quistes de células germinales disecados de las pupas a tiempo son capaces de desarrollar ex vivo en medio de cultivo. Haciendo uso de estas culturas permite imágenes microscópicas de las células germinales que viven en los testículos y de los quistes de la línea germinal. Es importante destacar que los testículos cultivadas y células germinales también se hacen accesibles a los inhibidores farmacológicos, permitiendo de este modo la manipulación de las funciones enzimáticas durante la espermatogénesis, incluyendo las etapas de post-meióticas.

El protocolo presentado describe cómo diseccionar y cultivar testículos pupa y quistes de la línea germinal. Información sobre el desarrollo de los testículos de pupa y condiciones de cultivo se proporcionan junto con los datos de imágenes de microscopio de testículos en vivo y quistes de la línea germinal en la cultura. También se describe un ensayo farmacológico para estudiar la espermatogénesis post-meiótica, ejemplificada mediante un ensayo de la orientación del interruptor de la histona-a la protamina usando el ácido anacárdico inhibidor de histona acetiltransferasa. En principio, este método de cultivo podría ser adaptado para abordar muchos opreguntas de investigación tros en la espermatogénesis antes y después de la meiosis.

Introduction

El desarrollo de las células germinales masculinas de muchas especies es un proceso secuencial. Se caracteriza por una serie de acontecimientos cruciales que culmina en la formación de espermatozoides morfológicamente y epigenetically altamente especializado. En Drosophila melanogaster, las células madre de línea germinal en la punta de la brecha testículo asimétricamente para dar lugar a una nueva célula madre y la spermatogonium, es decir, la célula hija que está comprometida con la diferenciación (ver Figura 1 para una visión general) 1,2 . La espermatogonia se somete a cuatro rondas de divisiones mitóticas y, con el inicio de la meiosis, una fase de crecimiento impresionante y la actividad transcripcional llama la etapa spermatocyte. Las células procedentes de una espermatogonia permanecen conectados el uno al otro y se desarrollan como un paquete sincronizado envuelto por dos células somáticas-una estructura que se refiere como un quiste. Después de la terminación de la meiosis, la morfología de las células germinales masculinas es completamentereorganizado (mostrado esquemáticamente en la Figura 1). Inicialmente, espermátidas redondas alargadas para formar la estructura de la cabeza hidrodinámico, y el flagelo desarrolla. Eventualmente, las células espermáticas se separan unos de otros por un complejo mecanismo, relacionada con la apoptosis llamada individualización 3-5.

En muchas especies, incluyendo Drosophila melanogaster y especies de mamíferos, los cambios morfológicos de las células germinales son acompañados por un reordenamiento epigenética notable del haploide masculina de la línea germinal de la cromatina, llamado el interruptor de la histona-a la protamina (conmutador HP) 6-9. Posiblemente casi todos histona canónica y muchas moléculas de histona-variantes son despojados a partir del ADN y son reemplazados por pequeñas proteínas básicas, las protaminas, resultando en la estructura núcleoprotamina muy compacto específico para la cromatina de esperma maduro. Características generales del conmutador HP son tque la sustitución de las histonas canónicas por primera vez por las variantes de las histonas, luego por las proteínas de transición, y finalmente por protaminas. Todo esto se acompaña de varios cambios en las marcas epigenéticas, tales como un aumento en los niveles de acetilación de la histona H4 justo antes de la eliminación de la histona 7,10 – 12.

La mayoría, si no todos, de los procesos antes mencionados son esenciales para el desarrollo de esperma maduro, totalmente fértiles. Esto es cierto no sólo en Drosophila, sino también en los seres humanos, como acciones espermatogénesis de mamíferos una cantidad considerable de similitud con el sistema 1,8,9 invertebrados. El estudio de desarrollo de las células germinales masculinas se facilita en gran medida en el sistema de modelo de Drosophila. Las moscas son genéticamente muy accesible. La generación de mutantes, así como el establecimiento de cepas de moscas que expresan genes de fusión o construcciones de ARN de interferencia necesita poco esfuerzo. Sin embargo, en el estudio de la espermatogénesis post-meiótica, el uso de mutantes de und herramientas genéticas simples podrían llegar a un límite. En Drosophila espermatogénesis, la transcripción cesa casi completamente con entrada en divisiones meióticas. Por lo tanto, la espermatogénesis post-meiótica se basa principalmente en mRNAs translationally reprimidos y almacenados sintetizados en una profase meiótica extendida 13-16. Por lo tanto, herramientas como ARN de interferencia o el uso de mutantes no condicionales no son adecuados para estudiar específicamente las funciones post-meióticas de los productos génicos que también cumplen funciones esenciales en el desarrollo de células germinales pre-meiótica o meiótica.

Una ventaja de Drosophila que puede ser explotado en tales casos es la capacidad de los testículos intactos disecados e incluso quistes de células germinales para desarrollar ex vivo en medio de cultivo 4,12,17 – 20. La disección y el cultivo de los testículos o los quistes de la línea germinal no sólo permite la observación microscópica del desarrollo de células germinales en las células vivas, pero unalso el uso de ensayos farmacológicos con, por ejemplo, los inhibidores de complejos enzimáticos tales como histona acetiltransferasas (HAT), las histona desacetilasas (HDACs), topoisomerasas, o el proteasoma. Por lo tanto, es posible manipular funciones enzimáticas durante la espermatogénesis post-meiótica y para monitorear los resultados del desarrollo independientemente de funciones embrionarias, pre-meióticas, o meióticas 4,12.

En los ensayos farmacológicos, se analizó previamente la localización acetilación dependiente de una proteína bromodomain durante la profase meiótica, así como la relevancia de los niveles de acetilación de histonas para el conmutador HP epigenética en la espermatogénesis post-meiótica utilizando inhibidores específicos dirigidos a las HAT y las HDAC 12,21. Targeting el interruptor de HP en estos ensayos fue posible mediante el uso de una cepa de mosca que expresa los genes de fusión histone2AvD-RFP y protamineB-eGFP 12,22 en los patrones endógenos, y la observación de quelos primeros espermátidas en testículos pupas pasan a través del interruptor de HP entre 24 y 48 horas APF 12.

El protocolo presentado describe la disección de los testículos y quistes de pupas Drosophila, las condiciones de cultivo, y un ensayo farmacológico con testículos pupa intactas. Para este propósito, los testículos pupa en alrededor de 24 horas después de la formación pupario (APF) se diseccionan (ver figuras 1 y 2). En este momento, los testículos no han hecho las conexiones a otros tejidos y están rodeados por una vaina exterior única delgada, lo que permite una mejor penetración de los compuestos inhibidores de 23,24. Los testículos son órganos Bean o en forma de pera que se pueden tomar fácilmente en la cultura. Estos testículos se disecaron, culta, y tratados con inhibidores específicos. Posteriormente, los efectos de los inhibidores se determinan con análisis de inmunofluorescencia y microscopía de fluorescencia de la expresión de proteína de fusión, y por comparación de la Morphol nucleargía de las células germinales tratadas a la de las células germinales no tratados. Las condiciones que se presentan en este protocolo también permiten imágenes en vivo del desarrollo de los testículos y quistes de la línea germinal en la cultura.

Protocol

Declaración de Ética: Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo implican trabajan exclusivamente con Drosophila melanogaster y no están sujetos a las leyes de bienestar animal en Alemania. 1 Preparación de los medios de comunicación, herramientas y moscas Preparar medio de crecimiento modificada disponible comercialmente en polvo M3 sin bicarbonato de potasio 17. PRECAUCIÓN: Irrita los ojos y la piel. Suplemento el medio con suero bovino fetal al 10%, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Utilice suero bovino fetal probado insecto-cultura-inactivado por calor y para mejores resultados. Filtrar el medio completo (denominado en lo sucesivo como medio) a través de una unidad de filtro de botella-top 0.2 micras y almacenar en alícuotas a -20 ° C. Antes de su uso, el filtro (0,2 micras filtro de boquilla de la jeringa) el medio de nuevo para eliminar precipitados. Preparar soluciones de inhibidor de acciones para los ensayos farmacológicos. DISSOLve los productos químicos en el disolvente apropiado y almacenar en alícuotas. Por ejemplo, preparar una solución madre de ácido anacárdico 28.69 mM (PRECAUCIÓN: Irrita los ojos y la piel) en dimetilsulfóxido. Preparar las herramientas para la interrupción de los testículos disecados pupa y la disección de los quistes simples. Use dos agujas afiladas y rígidas, en lugar de un par de fórceps. La fuerza capilar que se desarrolla entre los dos brazos de un par de pinzas hace la disección de quistes únicos en pequeñas cantidades de medio muy difícil. Por ejemplo, utilice la punta de un alfiler de insectos de acero inoxidable insertado en un soporte de asa de siembra. A fin de obtener pupas apropiadamente edad, semilla ca. 10 frascos de cultivo grandes (tubos con 4 cm de diámetro) con un número suficiente de moscas adultas (ca. 40-60 moscas). Para analizar el interruptor de HP, utilice moscas que expresan H2AvD-RFP y ProtamineB-eGFP en su patrón endógeno 12,16,22. Incubar los viales en condiciones estándar a 25; ° C durante alrededor de 4-5 días hasta que las larvas de tercer estadio de rastreo y comience la fase de pupa en las paredes de los viales 25. 2. Marcado o Recolección Blanco Pre-pupas obtener 24 horas de edad, pupas de disección Para probar la influencia de ciertas sustancias químicas en el switch HP, diseccionar testículos pupa a aproximadamente 24 horas APF 12. Para obtener pupas por etapas, tomar los viales de cultivo preparados con mosca pupating larvas (ver sección 1.4) e identificar el mayor número blanco pre-pupas posible. Pre-pupas durante el primer paso en la fase de pupa aparece como inmóvil, no se alimentan, las larvas y no abreviado con espiráculos evertidos y pupa de color blanco. La pupa se convierte en tan-marrón dentro de 30 a 60 min, lo que indica la siguiente etapa de desarrollo de pupa 26. Marcar las posiciones de la pre-pupas con un marcador permanente en el exterior de los viales. Incubar los viales a 25 ° C durante aproximadamente 24 h. Alternativamente,recoger el pre-pupas desde el lado de los viales con un cepillo pequeño humedecido con tampón PBS. A continuación transferir la pre-pupas a un lado de un tubo de reacción 50 ml fresco y se incuba a 25 ° C durante aproximadamente 24 h. 3. Disección de Pupal Testículos a aproximadamente 24 horas después de pupario Formación Distribuir varias gotas (aproximadamente 80 l cada uno) de media sobre 10 cm de cultivo celular de plástico o caja de Petri. El uso de un amplio par de pinzas o un cepillo humedecido con medio, recoger las pupas en la etapa de APF de 24 horas de los viales se incubaron (véase la sección 2). Transferir una pupa a cada gota de medio en el plato. Para la disección, utilizar un estereomicroscopio equipado con un iluminador de fibra óptica. No caliente los testículos anteriores RT durante la disección ya que esto podría impedir el desarrollo adecuado en la cultura. Diseccionar pupas con dos pares de No. 5 fórceps. Con un par, agarrar la pupa en su más posteriorparte (los espiráculos posteriores) y mantenerlo en su posición. Coge los espiráculos anteriores con el otro par de fórceps y abrir el opérculo de pupa en su extremo anterior. Despegar el caso de pupa hasta que al menos parte del tórax está expuesto. Siga pulsando la pupa en su posición por su extremo más posterior. Para liberar la presión interna de la pupa, inserte los dos brazos de un par de pinzas en la región de la cabeza de la pupa. Rip la pupa abierta mediante la apertura de la pinza y moviendo la pinza en la dirección anterior. Asegúrese de que la abertura generada con este movimiento es tan grande como sea posible en el primer intento. Evitar daños en la pupa en su extremo posterior antes de soltar la presión, ya que esto podría resultar en los testículos siendo empujados directamente a través de la pequeña abertura y más a menudo se interrumpen. Observe que una vez que se abre la pupa, la presión interna de lanzamiento de la pupa presiona cabo aglomerados de células de grasa corporal y el tejido a través de la laRGE apertura en la región de cabeza. Compruebe si los testículos pupa ya han sido expulsados ​​de la pupa con este material; esto ocurre en algunos casos. Los testículos no están conectados a cualquier otro tejido a las 24 h APF y por lo tanto pueden ser expulsados ​​fácilmente de la pupa 23. Evite apretar la pupa con las pinzas ya que podría dañar los testículos si permanecen en la pupa. Aumentar el tamaño de la abertura usando un par de pinzas. A continuación, mantenga la pupa en su extremo más posterior. Cierre el otro par de pinzas y suavemente racha de los contenidos de la pupa de posterior a anterior para liberar los testículos de la pupa. Recoge los testículos tirando de ellos en una punta de la pipeta precortadas 200 l. Trate de transferir sólo una muy pequeña cantidad de medio de reducir el número de células de grasa corporal transferidos con los testículos. Coloque los testículos en medio en una placa de cultivo fresco. Lave los testículos varias veces con medio hasta que sólo las células de grasa del cuerpo pocoss permanecen. Para imágenes en vivo, transferir los testículos a una placa de cultivo con fondo de vidrio con medio y el uso de un microscopio de imagen invertida. Para los ensayos farmacológicos, continúe con el paso 5. 4. Disección de quistes línea germinal de sexo masculino y de imágenes en vivo Transferir uno o más testículos de pupa a una placa de cultivo con fondo de cristal. Use un estereomicroscopio con iluminación de fibra óptica y dos agujas de acero inoxidable (ver sección 1.3) para la disección de los quistes de la línea germinal masculina. Con una aguja, trate con cuidado de precisar un testículo en su anterior o extremo posterior. Manténgalo en posición. Insertar la aguja en el otro testículo y perturbar la vaina testículo moviendo la aguja hacia los lados. Muchos de los quistes será lanzado desde el testículo por este movimiento. Continúe sujetando el testículo en su posición con una aguja. Suavemente racha de los quistes restantes de los testículos con la otra aguja. Quistes agregados separados ya sea por gently mover una aguja de lado a través de la agrupación de los quistes o mediante la transferencia de los quistes a una placa de cultivo fresco con medio usando una punta de pipeta de 200 l. Mueva la placa de cultivo a un microscopio de imagen invertida de imágenes en vivo de los quistes simples. Dispersar los quistes de nuevo con una aguja si es necesario. Identificar la etapa de los quistes mediante el uso de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Centrarse en un quiste de la etapa deseada. Confirmar el enfoque y la posición del quiste con frecuencia durante los experimentos de imagen más largos, ya que los quistes no se adhieren a la parte inferior de la placa de cultivo y por lo tanto tienden a flotar fuera de foco. NOTA: Recubrimiento el plato con poli-L-lisina para la inmovilización es perjudicial para el desarrollo de quistes de la línea germinal temprana. En lugar de ello, los quistes individuales pueden ser aislados. Con un poco de práctica, es posible señalar un quiste particular, por muy suavemente empujándolo con la aguja. Esto permitirá la transferencia de quistes únicos para culto separadaure platos con una pipeta Pasteur de vidrio con un extremo alargado que encaja en el campo de visión del microscopio. Los quistes aislados pueden ser fácilmente reubicadas en las placas de cultivo incluso después de la incubación a largo plazo. 5. Ensayo farmacológico con Intactos Testículos Pupal Llenar cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con 500 l de medio para un experimento de 12 repeticiones. Transferencia uno de pupa testículo a cada pocillo, usando una punta de pipeta precortadas 200 l. Verificar la presencia de protaminas en los testículos aisladas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Los testículos deben estar libres de señal ProtamineB-eGFP, que indica que el interruptor de HP no ha tenido lugar en cualquiera de los quistes. Vuelva a colocar los testículos que ya muestran quistes ProtamineB-eGFP-positivas. Para los primeros 12 pocillos, añadir 500 l de medio que contenía el compuesto inhibidor diluido (ácido anacárdico) para alcanzar la concentración final deseada(150 M) en 1 ml de medio por pocillo. Utilice los pozos restantes como controles no tratados; añadir 500 l de medio con la misma cantidad de disolvente utilizado como con los compuestos inhibidores. Nota: Si se utilizan muchos compuestos y disolventes diferentes, podría ser más eficaz utilizar medio solo como control y para probar la influencia del aumento de concentraciones de disolventes en experimentos separados. Incubar la placa a 25 ° C durante 24 horas en la oscuridad. Comprobar de nuevo la presencia de protaminas en los testículos incubadas como se describe anteriormente. Los testículos de control ahora deben mostrar quistes uno o más ProtamineB-eGFP-positivos, lo que indica la transición a través del conmutador HP. Usando una pipeta con una punta de 200 l, la transferencia de los testículos para diapositivas de poli-L-lisina-revestido, hacer los preparativos de squash y tinción con anticuerpos fluorescentes apropiados como se describe en otro lugar 12,27,28.

Representative Results

El testículo en los machos de Drosophila ya está formado en el embrión y persiste en la cavidad del cuerpo durante las etapas larvales. Tercer estadio muestran larvas testículos pequeños y redondos rodeados por una capa de futuras células de pigmento y embebidos en el tejido de grasa corporal (Figura 2A). Testículos en las moscas macho adultos son tubos largos y en espiral, que están cubiertos por una capa de células musculares procedentes del disco genital y una capa de pigmento 24. Curiosamente, los testículos de larvas contienen sólo las células de la línea germinal de las etapas de pre-meióticas meióticas y hasta la etapa de espermatocito primario, que corresponde a la profase meiótica (véase también la figura 1) 23. Los primeros grupos de células germinales masculinas pasan a través de la meiosis durante la formación pupario. En aproximadamente 24 horas APF, etapas post-meióticas con flagelos alargada ya han desarrollado, y todos los núcleos contienen histona H2AvD-RFP (Figuras 1 y 2B). Ninguna de las espermátidas haber sufrido tél interruptor de HP como sin señal ProtamineB-eGFP puede detectarse por microscopía de fluorescencia (Figura 2C). Con frecuencia, los testículos disecados en esta fase contienen una estructura auto-fluorescente de tamaño variable reminiscencia de un aglomerado de células de grasa corporal o de una a varias gotas de aceite (Figura 2C, punta de flecha). Esta estructura dentro del testículo es también visible con el microscopio de contraste de fase. Hasta la fecha, no hemos encontrado ninguna descripción de su naturaleza en la literatura. Los testículos disecados a 36 h APF aparecen alargadas y en algunos casos ya empiezan a rizarse (Figura 2D). Ya han unido a los tejidos del tracto genital que crece fuera desde el disco imaginal genital 23,24. Además, con frecuencia contienen las espermátidas primero más allá del interruptor de HP, como se indica por la señal de ProtamineB-eGFP (Figuras 1 y 2D, flecha). En 48 horas APF, los testículos tienen más alargado y claramente comienzan encrespa en laextremo proximal. Varios quistes línea germinal con núcleos protamina-positivo se hacen visibles (Figura 2E, flecha). Cuando testículos disecados a las 24 horas APF se mantienen en cultivo durante 24 h, no se alargan como en la mosca intacta (comparar Figura 2D y 2E con la Figura 6A '). Esto es posiblemente debido a la falta de señales de posición y de crecimiento normalmente enviados desde el tracto genital desarrollo de ponerse en contacto con el testículo en su punta posterior 23,29. Además, la capa muscular de la vaina testículos no se desarrolla debido a miotubos nacientes no pueden migrar desde el disco genital al testículo 24. Únicamente el pigmento delgada capa no parece El testículo-vaina en esta situación para crecer en cultivo suficientemente para envolver el número creciente de desarrollo de las células germinales dentro. Sin embargo, las células germinales crecen, se dividen y se diferencian de forma independiente de la vaina testículo. Por lo tanto, después de más de 36 hr en la cultura, los principios de los testículos se frecuentemente se abrió de golpe, y el desarrollo no se observa. Sin embargo, dentro de un marco de tiempo más corto, es posible grabar time-lapse imágenes ex vivo en directo de testículos enteros en desarrollo en la cultura, como lo demuestran las figuras 3A -3 C (véase también el vídeo Suplementario 1). Un testículo de pupa, diseccionado a aproximadamente 45 horas APF, se incubó en medio durante 6 horas y fotografiado cada 5 minutos. Dentro de este marco de tiempo, varios quistes de espermátidas emergen de la etapa de conmutación HP y muestran una (3A Cifras '-3 C, flechas abiertas) brillante señal ProtamineB-eGFP. Como se mencionó anteriormente, las células germinales masculinas en el testículo Drosophila se desarrollan como haces sincronizados de células interconectadas, quistes nombradas 1. Figura 4a muestra una visión general de los quistes diseccionadas de un testículo de pupa en APF alrededor de 24 hr. Etapas pre-meióticas, Etapas meióticas, primeras etapas de post-meióticas, y también quistes en la etapa de canoa temprano con núcleos alargados antes del interruptor de HP se puede encontrar (figuras 1 y 4B -4 E). Los quistes aislados son muy frágiles y deben manejarse con cuidado. Las dos células somáticas que forman la envoltura del quiste pueden ser fácilmente alteradas mecánicamente. Células madre de línea germinal tienen la capacidad de sobrevivir y continuar dividiendo después de la ablación genética de las células somáticas in vivo del quiste 30. Se ha informado de que in vitro, las células germinales de la etapa de 16 células separadas de su envolvente somática desarrollar aún más y diferenciar 19. De hecho, nos dimos cuenta en nuestro sistema de cultivo que espermatocitos presumiblemente a finales completaron divisiones meióticas con células quiste interrumpidos, aunque con muy poca frecuencia. Con mayor frecuencia, estos quistes interrumpidos cesaron desarrollo. Siguiendo el protocolo presentado, quistes intactos podría en algunos casos devElop en medio de cultivo ex vivo para un máximo de 72 h. Sin embargo, se observó que un número razonable de quistes sobrevivir hasta 48 horas de incubación. Dentro de este marco de tiempo, los quistes cultivadas son capaces de desarrollarse a partir de la etapa spermatocyte primaria hasta después de las divisiones meióticas, así como de la etapa núcleos ronda con cromatina basada en la histona hasta la etapa de canoa tarde más allá del HP cambiar 12. Esto permite imágenes en vivo de los procesos vitales en la espermatogénesis, como por ejemplo, entrar en espermatocitos divisiones meióticas (Figura 5 y vídeo Suplementario 2). Para este experimento, la variante de la histona RFP-etiquetados H2AvD fue utilizado como marcador cromosómico. La etapa de espermatocito primario se extiende durante aproximadamente 3 días in vivo 31. Por lo tanto, con el fin de grabar divisiones meióticas, elegimos quistes con espermatocitos que habían comenzado visiblemente condensación de la cromatina (Figura 5A, la región 2). División meiótica se inicia en espermatocitosen un lado del quiste y luego sigue en una onda en los espermatocitos restantes (en la Figura 5A de región a región 2 1, véase también el vídeo Suplementario 2). La condensación de la cromatina pronto conduce a los cromosomas en rápido movimiento que son visibles como puntos brillantes (Figura 5A, la región 2). Después de 30 min, los primeros espermatocitos de esta región ya están en la telofase (Figura 5B, puntas de flecha). Los cromosomas de la región más joven 1 ordenar en la metafase placa 20 minutos más tarde (Figura 5C). Ellos telofase completa y están dispuestos a someterse a la citocinesis unos 15 minutos más tarde (Figura 5D). Anafase, telofase y citocinesis duró aproximadamente 10 minutos en esta grabación (video Suplementario 2). En los mamíferos, así como en Drosophila, un pronunciado aumento de la acetilación de la histona H4 marca el inicio de la eliminación de las histonas y el interruptor de HP durante la post-meióticaespermatogénesis 6,11. Se ha propuesto que esta modificación epigenética es un componente esencial o incluso gatillo del programa de desarrollo de la HP cambiar 10,32. Anteriormente, hemos tratado testículos pupa de Drosophila en cultivo con inhibidores de la orientación HAT y las HDAC para influir en el nivel de acetilación de la histona H4 en las etapas post-meióticas 12. En estos ensayos farmacológicos, se encontró que la acetilación de histonas es esencial para la progresión de la espermatogénesis de etapas con cromatina basado en histona de etapas con la cromatina a base de protamina. Las figuras 6 y 7 muestran resultados representativos de un ensayo farmacológico con ácido anacárdico apuntar sombreros en testículos pupa. Testículos a las 24 horas APF fueron disecados de una cepa mosca expresar H2AvD-RFP y ProtamineB-eGFP. Proteína ProtamineB-eGFP estaba ausente en estos testículos pupal tempranas (Figura 6A y B). Después de 24 hr en la cultura, los testículos de control mostró señales ProtamineB-eGFP, lo que indica que los primeros quistes habían desarrollado más allá del conmutador HP (Figura 6A ', puntas de flechas abiertas). Este no fue el caso con los testículos tratados con 150 mM de ácido anacárdico (Figura 6B '). Preparaciones de squash testículo y análisis de inmunofluorescencia ofrecen información más detallada (Figura 7). En el control no tratado, los núcleos de los relativamente grandes espermatocitos primarios pueden ser reconocidos por su patrón característico de tres regiones de ADN ricamente manchado, que corresponden a las principales cromosomas (nivel 4C) de Drosophila (Figura 7A, columna 1). La acetilación de la histona H4 es claramente detectable en esta fase (Figura 7B, columna 1). La primera etapa después de las divisiones meióticas se conoce como la etapa de Nebenkern y se caracteriza por bastante grande, núcleos redondos (ver Figura 4C; no se muestra en la Figura 7). La siguiente etapa se muestra en la Figura 7 se identifica por el crecimiento flagelar y la forma redonda de los núcleos de células germinales, que ya son mucho más pequeñas que en etapas anteriores (Figura 7A, columna 2) y muestran muy bajo a niveles casi indetectables de acetilación de la histona H4 (Figura 7B, columna 2). La forma redonda a continuación, se alarga (Figura 7A, columna 3), y la acetilación de la histona H4 es de nuevo claramente detectable (Figura 7B, columna 3). Las espermátidas luego llegar a la etapa de forma de la canoa en el que el interruptor de HP tiene lugar y las histonas se sustituyen por protaminas (Figuras 7A – C 7, columnas 4 y 5). Después de la etapa canoa, los núcleos protaminated luego se alargan más en una forma de aguja muy fina en el esperma maduro (no mostrado aquí). Preparaciones de squash Testis de testículos tratados con ácido anacárdico mostraron resultados diferentes (Figuras 7D </ Strong> – 7 F). La cromatina en las células germinales tratadas con ácido anacárdico parecía más condensada que la del control no tratado (comparar Figura 7D, tratada y 7A, control). Los análisis de inmunofluorescencia reveló que la acetilación de H4 fue disminuido en gran medida o incluso ausente en los núcleos de las células germinales tratadas con ácido anacárdico (Figura 7E). Se sabe que las histonas altamente acetilados se asocian con las regiones de cromatina abierta, mientras que las regiones de la cromatina que carecen de la acetilación de histonas muestran con frecuencia una estructura represiva 33. Por lo tanto, no es sorprendente que el tratamiento con ácido anacárdico influyó en la estructura de la cromatina de los núcleos de células germinales tratadas. Es importante destacar que no se han identificado núcleos protamina-positivo de la etapa tardía canoa o más allá en los testículos tratados (Figura 7F). Por lo tanto, nuestros datos son consistentes con la idea de que la actividad HAT es esencial para la espermiogénesis proceder frocromatina a etapas de la cromatina a base de protamina m histona-basado. Figura 1 Descripción general de Drosophila espermatogénesis. El panel izquierdo muestra la secuencia de etapas en el desarrollo de las células germinales de una célula madre a los espermatozoides individualizada. Dibujos esquemáticos muestran la morfología nuclear característica de las células germinales. Uno spermatogonium divide para producir 16 espermatocitos interconectadas en un quiste. Durante esta etapa, la mayoría de las transcripciones necesarias para el desarrollo post-meióticas se producen, translationally reprimidos, y se almacena. El grueso de la actividad transcripcional termina con la entrada en las divisiones meióticas. El interruptor de la histona-a la protamina en la cromatina se lleva a cabo entre la etapa de canoa temprana y tardía. Etapas con una cromatina basado en histona son altosiluminado en rojo; etapas con una cromatina basada en protamina se resaltan en verde. Las barras en el panel de la derecha indican las etapas de las células germinales que normalmente se pueden encontrar en los testículos en desarrollo en larvas, pupas en aproximadamente 24 y 36 horas después de la formación pupario (APF), y las moscas adultas. Figura 2. testículos Drosophila en diferentes etapas de desarrollo. (A) Imagen de contraste de fases de un testículo de montaje en conjunto ligeramente aplastado de una larva de tercer estadio (L3). Sólo etapas pre-meióticas meióticas y se pueden encontrar. Espermatogonias están restringidos a la punta anterior debajo de la región de cubo (asterisco). El testículo restante se llena con espermatocitos (flecha abierta). Imagen de contraste de fases de un testículo ligeramente aplastado en ca. (b) 24 horas después de la formación pupario (APF). Además de espermatocitos (flecha abierta), el testículo contiene espermátidas en la etapa Nebenkern (puntas de flecha abiertas), con núcleos redondos y espermátidas en el alargamiento de las etapas con el crecimiento de flagelos (doble punta de flecha abierta) (C – E). Todo el montaje testículos pupal expresar H2AvD-RFP y ProtamineB-eGFP (superposiciones de contraste de fase y eGFP y imágenes de fluorescencia RFP). (C) testículo Pupal diseccionado a aproximadamente 24 horas APF. La punta de flecha marca auto-fluorescencia de putativo células de grasa corporal. D) Pupal testículos disecados a aproximadamente 36 hr APF muestra la primera quiste ProtamineB-eGFP-positivo (flecha). (E) Pupal testículo a aproximadamente 48 hr APF con un grupo de quistes ProtamineB-eGFP-positivas (flecha). En todas las partes de las figuras, los asteriscos indican la región de cubo. Las barras de escala: 100 m.ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. de formación de imágenes en vivo del interruptor de la histona-a la protamina en un testículo pupal crecimiento ex vivo. (A) Imagen de contraste de fases de un testículo pupa expresar H2AvD-RFP y ProtamineB-eGFP tenido en la cultura a aproximadamente 45 horas después de la formación pupario (APF). La vesícula seminal está indicado por una flecha lleno. Un paragonium (punta de flecha doble) permanece unido al testículo. (A ') y RFP eGFP fluorescencia del testículo se muestra en (A). La flecha abierta indica un quiste ProtamineB-eGFP-positivo. Barra de escala:. 100 m (B) Después de 2 h 30 min en la cultura, varios quistes adicionales (flecha abierta) emerger from la transición de la histona-a la protamina. (C) Después de una ca. adicional 3 h en cultivo, es decir, un total de 5 h 29 min en la cultura, un grupo de quistes (flecha abierta) con una fuerte señal de ProtamineB-eGFP es visible en el extremo proximal del testículo. Ver también el vídeo Suplementario 1. En todas partes figura, asteriscos indican la región centro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. quistes aislada de células germinales en diferentes etapas de desarrollo. Quistes (A) disecados de un testículo a aproximadamente 24 horas después de la formación pupario (APF). Superposición de contraste de fase y fluorescencia H2AvD-RFP (rojo) imágenes. Barra de escala: 100 m.Aumentos de quistes únicos de diferentes etapas – (E B). Superposición de contraste de interferencia diferencial (DIC) y las imágenes de fluorescencia H2AvD-RFP. Barra de escala:. 20 m (B) Quiste de 16 espermatocitos (C) Quiste de 64 espermátidas redondas en la etapa Nebenkern.. La estructura Nebenkern desarrolla a partir de las mitocondrias fusionadas y es visible en las imágenes DIC próxima al núcleo (punta de flecha abierta). (D) Quiste de espermátidas con núcleos redondos H2AvD-RFP-positivos y flagelos alargamiento (punta de flecha abierta indica una estructura Nebenkern alargamiento que acompaña a la creciente axonema). (E) punta apical de un quiste de espermátidas en la etapa de canoa temprano que muestra una forma alargada nuclear. Los flagelos extensamente alargada son sólo parcialmente visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 Imágenes en vivo de un solo quiste de 16 spermatocyte meiosis I ex vivo. Imágenes de fluorescencia de un quiste en la cultura que expresan H2AvD-RFP. Se representan etapas características de la meiosis I. Los espermatocitos en el quiste pasar a través de divisiones meióticas en una forma de onda. Condensación (A) Cromosoma comienza en los núcleos en un lado del quiste (2) y progresa a través del quiste (dirección indicada por la flecha ). Los núcleos en la región opuesta (1) representan una fase anterior de condensación de la cromatina, donde las regiones histonas densa que marcan los tres principales cromosomas todavía se pueden discernir. Espermatocitos en la región (2) contienen los cromosomas condensados, totalmente visible como manchas fluorescentes brillantes. (B) Después de 300; min, los primeros espermatocitos en la región (2) se encuentran en la telofase (puntas de flecha en blanco), mientras que el cromosoma condensación continúa en la región (1) (C) En los últimos espermatocitos de región (1), los cromosomas (puntas de flecha) se disponen. en la metafase placa de 20 minutos más tarde. (D) Dentro de otros 15 minutos, los últimos espermatocitos parecen haber completado telofase y ahora están dispuestos a someterse a la citocinesis (puntas de flecha abierta). Ver también Suplementario de vídeo 2 Barra de escala:.. 50 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. ácido anacárdico inhibe el interruptor de la histona-a la protamina en testículos pupa cultivadas. Testículos Pupal expressi ng H2AvD-RFP y ProtamineB-eGFP y se diseccionaron a las 24 h después de la formación pupario (APF) se incubaron durante 24 horas en medio sin inhibidor (control; A, A '; DMSO, dimetilsulfóxido) o en medio suplementado con 150 mM de ácido anacárdico ( B, B '). Hub regiones indicadas por asteriscos. (A, B) No hay quistes ProtamineB-eGFP-positivo se pueden observar después de la disección. (A ') Después de 24 horas de incubación, algunos quistes sufrieron la histona-to-protamina interruptor y ProtamineB-eGFP-positivo quistes (puntas de flecha abiertas) se pueden observar. (B ') Testículos tratados con ácido anacárdico no desarrollan quistes ProtamineB-eGFP-positivas. Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 7. ácido anacárdico afecta acetilación de la histona H4 y la estructura de la cromatina de espermátidas preparaciones de squash de núcleos spermatid de testículos pupa (24 hr APF) que expresa ProtamineB-eGFP incubó durante 24 horas sin inhibidor (A – C). O con 150 M de ácido anacárdico (D – F). ADN teñido con colorante Hoechst (A y D). Acetilación H4 analizó immunofluorescently (B y E). Presencia de protaminas monitorizados con la señal ProtamineB-eGFP (C y F). Después del tratamiento con ácido anacárdico, la cromatina aparece fuertemente compactado (D) y la señal de acetilación H4 está completamente reducido en todas las etapas spermatid (E). Además, se trató-ácido anacárdico latestículos no muestran quistes de la etapa canoa tarde o más allá y no hay señal ProtamineB-eGFP (F). Barra de escala:. 10 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Suplementario vídeo 1. imágenes en vivo a través de eGFP y RFP fluorescencia del interruptor de la histona-a la protamina en un testículo pupa crecimiento ex vivo. Vídeo de imágenes transcurso de tiempo de 6 horas ilustra la transición de la histona-a la protamina por el aumento de la prevalencia de ProtamineB- quistes eGFP-positivas. Las imágenes fueron adquiridas cada 5 minutos. Para más detalles, véase la Figura 3. (Ver "suppl_video_1.MOV" zona de descargas). Suplementario vídeo 2. de imágenes en vivo de un solo quiste de someterse a 16 espermatocitos meiosis I ex vivo. Time-lapse imágenes fluorescentes de unquiste en la cultura expresando H2AvD-RFP en el transcurso de 80 min. Este video muestra las etapas características de la meiosis I. Las imágenes fueron adquiridas cada 1 min. Para más detalles, véase la Figura 5. (Ver "suppl_video_2.MOV" zona de descargas).

Discussion

El protocolo presentado describe dos aplicaciones diferentes basadas tanto en la capacidad de diseccionar testículos de Drosophila y quistes sola línea germinal en una etapa de desarrollo determinada y en el desarrollo ex vivo de estas células y tejidos en una placa de cultivo. Una aplicación es la manipulación farmacológica de los procesos vitales durante el desarrollo del esperma. Es importante destacar que, esto permite el acceso a la espermatogénesis post-meiótica que no se obtiene fácilmente usando análisis funcionales basadas en la genética de la mosca. La otra aplicación es la observación microscópica de la vida y el desarrollo de las células germinales y los testículos. Especialmente esta aplicación se beneficia de la capacidad de las células de Drosophila y de los órganos en la cultura para sobrevivir y desarrollarse a temperatura ambiente y en atmósfera normal. Por lo tanto, un microscopio invertido equipado de formación de imágenes con una etapa calentada (calentamiento a la temperatura de cría estándar de 25 ° C) es suficiente para obtener resultados significativos en los experimentos de formación de imágenes en vivo. Ademásexisten más, muchas cepas de moscas transgénicas que expresan proteínas proteínas etiquetadas fluorescentes para imágenes en directo o se pueden establecer fácilmente.

Para obtener testículos pupa o quistes de la línea germinal de una etapa específica del desarrollo, es crucial que uno está familiarizado con el momento del desarrollo de Drosophila. El tiempo exacto para cada etapa puede variar entre los laboratorios, las condiciones de cultivo, y volar cepas y debe ser establecida empíricamente. Como se indica anteriormente, esto es especialmente importante para los ensayos farmacológicos que, por ejemplo, el interruptor se dirigen a HP. Para tales experimentos, es aconsejable comprobar siempre para espermátidas con una señal ProtamineB-eGFP antes de la prueba inhibidor real porque el tiempo puede variar ligeramente incluso dentro de una población.

Siguiendo el protocolo anterior debería permitir al experimentador para diseccionar testículos de pupa tempranas como órganos intactos gratuitas de tejido corporal grasa adherida. Estos testículos y, más aún, aislados gequistes rm línea son muy frágiles. Por lo tanto, es crucial para desarrollar la destreza manual y la experiencia necesaria para el manejo y la transferencia de los testículos y quistes usando pinzas, agujas y pipetas. Especialmente los estudios dirigidos al desarrollo de las células germinales post-meióticas meióticas y principios se beneficiarían de esto. Mientras que es relativamente fácil para diseccionar quistes de espermátides tardías con flagelos largo de testículos adultos, es difícil obtener las fases anteriores. La disección de estos quistes de testículos pupa principios siguientes de este protocolo es mucho más eficiente. Tenga en cuenta que en una cepa habitual mosca, sólo alrededor del 50% de las pupas será varón. Por lo tanto, se preparan para diseccionar al menos dos veces como muchas pupas como el número de testículos requeridos. Alternativamente, es posible identificar macho larvas L3 utilizando un estereomicroscopio, como los testículos se pueden identificar órganos redondas como translúcidos incrustados en los tejidos corporales de grasa laterales de la larva intacta 23,34, y para recogerlas en frascos de cultivo frescos que puedese usará para escoger pre-pupas para la estadificación y disecciones. También es posible identificar macho pre-pupas 35.

Nos dimos cuenta de que tanto los quistes aislados de la línea germinal y los testículos pupa intactos en la cultura son sensibles a la luz, como también se ha reportado previamente 18. Esta sensibilidad a la luz también puede mantener durante algunos compuestos químicos que se utilizan en los ensayos farmacológicos. Por lo tanto, lo mejor es mantener las placas de cultivo de un ensayo en la oscuridad durante la incubación. Del mismo modo, en la planificación de los experimentos de imagen de lapso de tiempo con los testículos en desarrollo y, en especial, los quistes aislados, tenga en cuenta que los tiempos de exposición demasiado largas y / o demasiado altas velocidades de muestreo pueden inhibir ex vivo el desarrollo. La tasa de muestreo apropiado debe ser determinado experimentalmente.

La infección bacteriana y / o fúngica y el exceso de crecimiento en las placas de cultivo plantea un problema grave. Placas de cultivo infectadas con demasiadas bacterias no admiten ex vivo deverrollo de los testículos y quistes. Por lo tanto, el medio de cultivo descrito contiene penicilina y estreptomicina (véase el paso 1.1), pero durante la incubación a largo plazo, estos antibióticos pueden ser degradados y su actividad pueden disminuir. Esto podría ser una de las razones para el limitado tiempo de supervivencia (máx. 72 hr) de quistes cultivadas observados cuando se utiliza el protocolo anterior. Sin embargo, este plazo no podría extenderse por sustitución periódica del medio de cultivo en los platos. Llegamos a la conclusión de que otros factores pueden influir en la supervivencia en cultivo, tales como la falta de señales de crecimiento de otros tejidos del tracto genital. Por otro lado, el desarrollo post-meiótica es más rápido en Drosophila que en los mamíferos. En Drosophila, la espermiogénesis tarda aproximadamente 90 horas, y el interruptor de HP tiene lugar entre 50 y 60 horas después de la meiosis 9,12. Por lo tanto, el tiempo de supervivencia habitual de alrededor de 48 hr logrado con este protocolo es muy adecuado para seguir los procesos de desarrollo clave en SPErmatogenesis, tales como divisiones meióticas o el interruptor de HP. Aunque la contaminación bacteriana o por hongos se puede evitar mediante el uso de herramientas y medios limpios, el protocolo presentado no hace uso de las condiciones de trabajo estrictamente estériles porque las moscas y volar testículos ya contienen bacterias cuando son criados en condiciones normales. Sin embargo, algunas aplicaciones de esta técnica de cultivo podrían beneficiarse de moscas disecadas o incluso elevada en condiciones asépticas (para los protocolos, ver 17,36,37).

Ensayos farmacológicos dependen del uso de compuestos químicos que actúan como inhibidores o activadores de diversas enzimas. Los compuestos comúnmente usados ​​en tales experimentos a menudo difieren ampliamente en su especificidad de diana. Como ventaja, esto ofrece el potencial para apuntar clases de enzimas enteros, por ejemplo, con ácido anacárdico p300 que inhiben / CBP, PCAF, y miembros de la familia MYST de HAT 38. La desventaja de esto podría ser posible fuera de objetivo o efectos citotóxicos induccado por tales compuestos. Por lo tanto, cada uno compuesto utilizado en un ensayo con testículos o quistes pupa debe ser probado por su citotoxicidad y efecto específico en diferentes concentraciones. Además, ligeras variaciones en las condiciones de cultivo, concentración de compuesto o de actividad, y las variaciones en la permeabilidad celular podría dar lugar a la variabilidad de los efectos inducidos. Por lo tanto, es necesario controlar el éxito del tratamiento en cada experimento. Por ejemplo, cuando se utilizó ácido anacárdico a 150 M, se observó una ligera variabilidad en la fuerza de la condensación de la cromatina entre fenotipo y algunas veces dentro de los testículos, mientras que la acetilación de la histona H4 se disminuyó consistentemente.

Ensayos farmacológicos con testículos de Drosophila en la cultura se han utilizado para analizar los mecanismos de pre-y post-meióticas de espermatogénesis 4,12,14,21. Puesto que es difícil acceder a la espermatogénesis post-meiótica con herramientas genéticas para apuntar jugadores con essential funciones de pre-meióticas y meióticas, este enfoque ex vivo constituye una alternativa. Además, en principio, el método podría adaptarse a pulso-caza experimentos para seguir el desarrollo de las células germinales tratadas con el tiempo. Sin embargo, todavía no hemos probado esta posibilidad. Haciendo uso de principios de testículos de pupa es una ventaja en ensayos farmacológicos. En primer lugar, la vaina externa delgada de los testículos pupal jóvenes (alrededor de 24 hr APF) podría permitir la mejora de la permeabilidad de compuestos químicos. En segundo lugar, cuando se estudia el interruptor de HP después de la meiosis, los testículos disecados pupa a las 24 horas APF desde la línea de la mosca de protamina-GFP-expresando permiten una lectura directa de si el interruptor de HP fue afectado o no.

Hasta la fecha, varios protocolos para el cultivo ex vivo de órganos y tejidos, incluyendo los testículos y quistes de la línea germinal de Drosophila se han desarrollado (por ejemplo, véase 4,14,17,20,39,40). El medio de cultivo y las condiciones generales usadosen el protocolo presentado aquí fueron establecidos en 1979 17. El sistema de cultivo fue adaptado más adelante para imágenes in vivo del mecanismo de individualización en los quistes post-meióticas finales de los aislados a partir de testículos adultos 4. Anteriormente, nos hemos informado de que estas condiciones también son compatibles con la supervivencia y la diferenciación de las células germinales meióticas y post-meióticas tempranas en sus quistes por alrededor de 48 horas 12. A diferencia de otros sistemas de cultivo de 19 el calendario de desarrollo observado en estos cultivos fue de aproximadamente consistente con el tiempo determinado a partir de muestras fijas (para más detalles, véase 12). Señales de fluorescencia de RFP y H2AvD-protamina-GFP se pueden utilizar para visualizar la morfología y composición de la cromatina nuclear de las células germinales en cultivo. Se encontró que para una identificación clara de las etapas de desarrollo en cultivo, esto es ventajoso sobre otros criterios, tales como el enrollamiento de los quistes. Es importante destacar que, el protocolo presentado no implica la adición de mosca extfactores de crecimiento u otros RACT distintos de suero fetal bovino. Además, se muestra aquí que las condiciones sean compatibles con las imágenes de microscopía de fluorescencia de las divisiones meióticas ex vivo en la cultura. Las imágenes se pueden obtener con la resolución razonable en un medio fácil de usar que es compatible con el desarrollo a largo plazo. Esto está en contraste con los protocolos que permite observaciones a corto plazo (aproximadamente 3 horas) en aceite Voltalef 41,42.

Los procedimientos descritos anteriormente para el cultivo y el tratamiento farmacológico de los testículos de pupa y quistes de la línea germinal machos individuales son fácilmente adaptables a los muchos genética, epigenética, célula biológica, o preguntas de desarrollo que puede ser investigado en Drosophila espermatogénesis. Esto incluye especialmente la investigación se centra en las células madre de línea germinal. Se ha demostrado que el desarrollo de células madre puede ser seguido por formación de imágenes en vivo de testículos de adultos cultivadas 20,43. Sin embargo, el movimiento peristáltico de los testículos madura sheath interfiere con la adquisición de la imagen. Por lo tanto, ya sea de formación de imágenes se realiza utilizando testículos fragmentados 43 o el número de experimentos de imagen realizadas tiene que ser aumentada para dar cuenta de los conjuntos de datos perdidos 20. Testículos pupa tempranas (APF 24 hr) aún no se adjuntan a las células musculares. Incluso ligeramente testículos mayores (APF 36-45 hr) parecen mostrar algunos movimientos peristálticos (comparar Figura 3 y video Suplementario 1). Por lo tanto, el cultivo de los testículos pupas jóvenes como órganos intactos podría servir como alternativa.

Además, una vez dominado, la capacidad para diseccionar testículos pupa y eventualmente aislados quistes de la línea germinal permitirán más aplicaciones que utilizan quistes únicos como una fuente de un homogénea, aunque pequeña, la población celular. Por ejemplo, de este modo es posible llevar a cabo RT-qPCR para analizar la regulación transcripcional de genes específicos durante las etapas definidas de la espermatogénesis, como ya se ha demostrado <sup> 15.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Materials

Anacardic acid Merck Millipore 172050 brand: Calbiochem (EMD Millipore)
Anti-acetyl-Histone H4 Merck Millipore 06-598 brand: Upstate
AxioCam MRm  Zeiss
AxioObserver.Z1 inverted microscope Zeiss
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Dumont 5-Inox forceps Dumont multiple suppliers
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Sigma F4135
Fiber optical  illuminator multiple suppliers
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek P35G-1.5-14-C
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 Dianova 711-175-152
Hoechst Sigma B1155
Inoculation loop or pin holder multiple suppliers
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 Plano GmbH N5018 In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm Plano GmbH N5014
Multiwell plates, 24-wells Becton Dickinson 351147 brand: Falcon
Pen Strep invitrogen 15070 brand: Gibco
Shields and Sang M3 Insect Medium Sigma S8398
Stemi SV6 binocular Zeiss
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Gärtner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment. J. Vis. Exp. (91), e51868, doi:10.3791/51868 (2014).
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